Biochimia omului

EXPRIMAREA ACTIVITAtII ENZiMATICE

Pentru a exprima activitatea enzimei sunt necesari unnatorii factori: ecuatia sumara a reactiei; metoda de analiza; cofactorii enzimei, ionii sau coenzimele ei; valoareaConstanta dupa Michaelis; pH §i T°C optime.
In practica biochimica curenta sunt importante variatiile de activitate, $i nu activitatea absoluta. Se ia o anumita imitate arbitrara, care serve?te drept referinta.
- Unitatea Intemationala (U.I.) e acea activitate enzimatica ce asigura conversia a 1 jxmol de substrat intr-un minut in conditii standardizate de pH, T° C (25-30). Cofactorii §i alte conditii optime asigura actiunea enzimelor.
- Katalul (kat) constituie activitatea care asigura transformarea unui mol de substrat intr-osecunda (lmkat = 60U.I),(l U.I. = 16,67 nkat).
Semai utilizeaza:
- activitatea specified — numarul de U.I. cu referinta la Imgproteina;
- activitatea moleculara - numarul de molecule de substrat transformate de catre o molecula de enzima intr-o secunda — numarul turnover ( carbanhidraza - 36 milioane pe minut, catalaza - 40.000.000/sec.);
- activitatea oxidoreductazelor cu coenzima NAD+ sau NADP4^ se exprima prin cre$terea sau descre$terea extinctiei la 340 nm {absorb numai formele reduse). Ca imitate serve§te cre§terea sau scaderea cu 0,001 a extinctiei intr-un minut.
La reactiile fermentative ale metabolismului iau parte cnzimelc care se leaga cu moleculelc diferitclorsubstraturi. Exemplu:
E
Glucoza + ATP G!ucozo-6-P + ADP (E - hexokinaza)
Reactiile cu participarea a 2 §i maimultesubstraturiincludtransferulatomilorsau grupelor functionale de la un substrat la altul. Atare reactii decurg in doua moduri.
Primul tip de reactii — reactii de substitute unitara: 2 substraturi A $i B se leaga specific sau sporadic cu enzima, rezultind fonnarea complexului EAB cu scindarea lui in C §i D (fig. 1.23); al doilea tip de reactii — reactii ce decurg confonn mecanismului suhstitutiei duble (de tipul «ping-pong»). In astfel de reactii CA al enzimei in fiece moment leaga un substrat.
Figura 1.23. Reactii de substitute unitara
Aditionarea primului substrat e insotita de transfeiul giupei functionale pc enzima $i numai dupa eliminarea produsului fonnat din primul substrat poate sa aditioneze la enzima §1 al doilea substrat, dupa care sa reccptionezc giupa fimctionala:
AX + B —^ A + BX (fig. 1.24).
- 6 8 -
Figura 1.24. Reactii de substitute dubla
Amaccentuat ca enzimaaccelereazavitezareactiilorcatalizatede 108 - 1020 ori. Ureaza la pH = 8 §i T= 20 C mare§te viteza reactiei de 1014 ori.
Care este mecanismul ce atribuie enzimelor o activitate intensa in conditii atit de subtile?
Sunt antrenati 4 factori decisivi:
1. Apropierea ?i orientarea substratului de grupa cataliticd. Legatura chimica explorata a substratului se afla nu numai foarte aproape, dar ?i direct orientata fata de grupele catalitice. In consecinja, probabilitatea ca complexul ES va atinge starea de tranzitie se amplified.
2. Tensionarea $i deformarea sunt intr-o concordanta indusa: alipirea substratului produce modificari conformationale in molecula enzimei, tensionind structura CA, concomitent deformindu-se §i substratul legat, ceea ce favorizeaza atingerea starii de tranzitie a complexului ES. Apare concordanta indusa, adica modificari in structura tertiara §i cuatemara a molcculci enzimaticc.
3. Cataliza generald acido- bazica. in CA al enzimei conlucreaza grupe specifice ale resturilor de aminoacizi, servind drept donatori sau acceptori de protoni. Grupele acide §i bazice reprezinta catalizatori efectivi ai multor substante organice din solutiile apoase (fig. 1.25).
R2
<-C—Rl
.195
O
COO
SI-I;
OH; -NH
3 >
R2—NH,
HN
Nil
4. Cataliza covalenta. Enzimele reactioncaza cu substraturile, formind compu$i ES nestabili legati covalent, care in reactiile ulterioare formeaza produsul reactiei mult mai rapid decit in reactiile necatalizate. Compusul covalent e nestabil §i se hidrolizeaza mult mai rapid decit R.
RX + E- OH —^ R-OH + EX EX + HOH —*-
-69-
E-OH + HX
Enzimele stimuleaza diferite procese metabolice in celule, fiind organizate in sisteme (sau complexe) multienzimatice, in care enzimele activeaza coordonat. Ele genereaza rcactii succcsive ale unci anumite cai metabolice. Produsul primei reactii din astfel de sisteme devine substratpentru cealalta enzima.
Sistemele multienzimatice pot include 15 §i mai multe enzime, care activeaza intr-o anumita succesiune. In fiecare sistem exista un ferment cu rol de dirijor, care determina viteza tuturor reactiilor catalitice din lant, fiindca catalizeaza stadiul-limita, adica reactia cea mai lenta, ce determina viteza procesului in intregime. Enzimele de acest tip indeplinese nu numai fimetia catalitica, dar §i cea de modificator al propriei activitati (), ca respondente la diferite semnale.Carezultat, fiecare reactie metabolica i§i schimba viteza, fapt ce conduce la adaptari rapide. in conditiile noi apare oadaptare imediatd, de avarie. in aceasta categorie logic se include transformarea enzimei neactive in activa, sub inlluenta factorilor atit specifici, cit §i ncspecifici.
In majoritatea sistemelor multienzimatice fermentul-dirijor catalizeaza prima reactie din lantul lor consecutiv. Cantitatea suficienta de ceilalti fermenti determina activitatea catalitica intensiva, mdeplinind indicatiile dmjomlui §i intensificindu-§i activitatea la cre§terea cantitatii de substrat.
Enzimele, activitatea carora se gase.pe sub influenta unor semnale molecu- lare, sunt numite enzime reglatoare. Exista 2 clase de astfel de enzime: una — alosteric reglate (Alio stereos - alt loc) de modulatori ce se fixeaza necovalent, §i a doua — enzime ce se regleaza prin modificari covalente.
ENZIMELE ALOSTERICE. Ele poseda cu totul alt sau alte centre decit cel activ, in care sunt fixati liganzii. Ce le este caracteristic acestor enzime?
1. Poseda, ca §i toate enzimele, centru catalitic, unde se fixeaza $i se modifica sub- stratul, dar mai poseda un alt centru care are o pozitie spatiala pentru fixarea metabolitului reglator, numit efector sau modulator. Acest centru e specific pentru fiecare modulator.
2. Moleculele enzimelor alosterice sunt mai mari, mai complexe §i primordial oligomerc pare.
3. Aucinetica lor — viteza reactiilor, in dependenta de concentratia substratului, are forma sigmoidala, dar nu hiperbolica, cauzata de urmarile interactiunii intre protomeri ce leaga substratul in mod cooperativ (exemplu — mioglobina §i hemoglobina—fig. 1.26).
Exista 2 tipuri de enzime alosterice:
a) homotrope in care modulatorul §i substratul constituie aceea§i substanta.
Acumularea substratului activeaza viteza rcactiei catalizate dc aceasta enzima:
Mioglobina
Figura 1.26. Curbele de oxigenarc ale mioglobinei (Mb) $i hemoglohinei (Hb)
-70-
Hexokinaza
Glucoza + ATP —»- G-6-P + ADP
(de altfel, ca §i alcoolul ce activeazS enzima ce il scindeaza - alcooldehidrogenaza);
b) heterotrope — enzimele sunt reglate de 4 modulatori care diferS dupS structurS de i substrat, multi dintre ei avind actiune antipodS.
La fixarea modulatorului, enzimele alosterice i§i modifies conformatia. Modulatorii accelereazS sau inhibS utilizarea substratului de enzima respective (fig. 1.27).
Unele sisteme enzimatice manifests 0 parti- cularitate deosebitS: produsul final al sistemului inactiveaza enzima—un rezultat al activitStii mai
productive a sistemelor multienzimatice, decit e necesar celulei. Acest produs final actioneazS ca un inhibitor specific al primei enzime §i, ca rezultat, viteza sistemului se echili- breazS in corespundere cu cerintele celulei - retroinhihi- tie sau inhibitie prin produs final, inhibitie de tip feed back. TransformSrile L-treonina —L-izoleucina necesitS 5 enzime. Prima enzima e treonindehidrataza, inactivatS de izoleucinS, modulator ce se fixeazS in CA. Este un exemplu clasic de reglare necovalentd §i e reprodus in fig. 1.28.
Se inregistreaza enzime reglatoare, labazaactivarii carora se atesta modificari covalente ale moleculei:
E
Glicogenn + P —Glicogenn, + Glucozo-l-P
coo
h3n-c-h
H-C-OH
ch3
L-treonina
r
. Treonin :i dehidrataza
pozitivi (+) $i negativi (-) asupra cinelicii reacfiilor catalizale de enzimele alosterice
1 D
i E,
1
1
COO-
] H3N-C-H
v—H-C-CH,
.... CH2
L-izoleucma |
CH3
Figura 1.28. Inhihitia de tipul feed back. Conversia L-treoninei in L- izoleucina catalizata de o succesiune de enzime. Treonindehidrataza Et este inhibata de produsul final
Enzima fosforilaza A (forma activa constiluie un dimer compus din 2 protomeri idcntici, fiecare avind rest specific de serina, fosforilat pe grupa OH) catalizeaza reactia. Fosfataza fosforilazei catalizeaza hidroliza legaturii P cu serina §i transfers F «A» in F «B» mai putin activS. Kinaza fosforilazei catalizeazS transferul grupei P de la ATP la OH serinei $i reactiveazS activitatca enzimei (“B” —^ ”A”) (fig. 1.29).
Trecerea dintr-o fonnS in alta e insotitS de modificari ale structurii cuatemare ce atinge centrul activ, regleazS activitatea enzimei. Asocierea protomerilor “B”activeazS “A”.
Reactiile catalizate de enzimele alosterice sunt ireversibile, au AG - negativS. Exists §i alte modificSri covalente ale enzimelor — metilarearesturilordeami- noacizi, aditionarea adenilatului etc.(lig. 1.30).
La unele enzime foarte complexe activitatea poatc fi reglata atit covalent, cit §i necovalent.
O categorie de enzime sunt sintetizate in forma neactiva de precursor, care se activeaza la o proteoliza limitata (proenzimele). Exemplu:
1) enzimele digestiei ce scindeaza proteinele in stomac §i duoden - pepsinogenul, chimotripsi- nogenul, tripsinogenul, proelastaza, procarboxi peptidaza;
2) coagularea singelui e determinate de avalan$a de reactii cu actiune proteolitica;
3) hormonii proteici (insulina);
4) proteinele fibrilare (colagenul).
Exista o grupa de proteine-enzime, starea activa a carora e conditionata de impachetarea spontana a moleculelor cu formarea unei structuri tridimensionale caracteristice enzimei date (lizozim).
Fosforilaza B
Fosfataza
fosforilazei
2P:
y-2H.O
Kinaza
fosforilazei
Figura 1.29. Reglarea activitatii glicogen fosforilazei prin modificarile covalente
Modificarile covalente Resturile de aminoacizi accep-
p, tati in modificarile covalente
ATP ADp 'll
^ Pn7— fi
Tyr, Ser, Thr, His
Fosforilarea
Enz
Enz
Adenilarea
ATP PPi
- Enz— P— O I- O
o
Enz—P—O CH 2 o Adenina I '
O'
Tyr
UTP
PPi
0
OH OH
Enz
ADP-ribozilarea
Enz
Uridilarea
NAD Nicotinamida
•Enz-P-O-CH, O. Uracilul
4- ft vl
/ H
Tyr
OH OH O
I?
Enz O^ CH2-0-P-0-P-0-CH
H>_f H
OH Oil
I
O
o
0 Adenina
i
S-adenozil S-adenozil
Metilarea metionina homocistcina
Enz
—Enz— CH 3 Figura 1.30. Exemple de modificdri covalente ale diferitelor enzime
OH OH Arg, Gin, Cys
Glu
- 1 2 -
Figura 1.31. Modelul simetric defixare cooperativa a substratului
Inhibitor alosteric
in 1922 Al. Fleming descopera, intr-un mod deosebit, lizozimul, iar in 1929 tot dinsul descopera §i pcnicilina.
Mccanismul interactiunii alosterice
In 1965 savantii J. Monod, J. Wyman, J. Changeux au propus un model fin ?i clar al interactiunilor alosterice (MWC)
— modelul simetric sau “concert trat”, avind urmatoa- rele caracteristici cardinale (fig. 1.31):
1. enzima alosterica este compusa din 2 subunitati identice, simetrice, cu un centru activ, centrele fund echivalente;
2. enzima (oligomcrul) poate exista in doua stari: T- tensionata (constnnsa), cu afmitate mica de substrat, §i R- relaxata, cu o afmitate mare de substrat;
3. conformafia fiecarui monomer este constrinsa de asocierea cu ceilalti monomeri;
4. formele T §i R pot trece din una in alta §i se afla in echilibm T —^ R;
5. pentru acest model se face o exceptie: intru a pastra simetria dimerului, ambele subunitati trebuie sa adere la aceeafi conformatie.
in lipsa substratului, toate molcculele se afla in forma T (la 104 molecule — o molecula poate capata forma R).
Prezenta substratului modifica conformafia, ducind la aparitia formei R. Cind substratul se leaga cu centrul activ, celalalt la fel trebuie sa se afle in R - stare. Treccrea de la T la R §i viceversa se produce coordonat. La aditionarea substratului partea moleculara a enzimei in starea R progreseaza §i fixarea substratului devinc cooperativa. La o saturatie completa toate moleculele enzimei se fixeaza in R stare.
Inhibitorul sc leaga cu forma T, activatorul — cu fonna R, astfel efectele homotrope devin pozitive, iar cele heterotrope
— pozitive sau negative (fig. 1.32).
D.Koshland, G.Nemethy §i D.Filmcr (KNF) propun modelulseevential, mai clasic (fig. 1.33). Baza lui constituie trei postulate:
1. fiecare monomer poate exista in una din conforma- tiile posibile - T sau R;
2. fixarea substratului modifica forma doar a unei subunitati, cealalta nu sufera modificari vadite;
3. modificarile conformationale determinate de substrat la o subunitate pot mari sau mic§ora afinitatea la substrat a celorlalte subunitati. Fixarea este cooperativa.
Deosebirileintre modcle: cel simetric nupresupune echilibruintre formele R 51 Tin lipsa substratului, dar din contra, fixarea substratului induce trecerea T —► R.
FonnaT
Activator alosteric
Forma
Figura 1.32. Inhibitorul alosteric stabilizeuza forma T, pe cind activatorul respectiv —forma R
-73-
s
l
In accst model esentialS este simetria monomerilor.
Modelul seevential denotS cS trecerea de la T la R in diferite subunitSti are loc coordonat §i intr-o anumitS succesiune. Un rol primordial are fonna hibrid RT. Monomerii interactioneazS cu conditia prezentei fbrmei confonnationale diferite. Inultimul model (seevential) efectul substantelor homotrope poate fi pozitiv $i negativ. FixareadeenzimSa douS molecule de substrat depinde efectiv de natura modificarilor stxucturale, determinate de fixarea primei molecule de substrat.
Recent se considers ca aceste modele reprezintS doua cazuri aparte de interactiune. In realitate ea e mult mai complexS, dependents de particularitStile structurii cuatemare, tertiare etc.
E stabilit ca sub actiunea guanidinhidroclorurei (G4HC1) sau a ureei inactivatia unor enzime are loc la concentratii relativ mici ale agentilor denaturanti, in care nu se observS modificSri globale in conformatia moleculei. Studiile recente confinnS ca pierderea activitStii fennentative e detenninatS de mic§orarea mteractiunii in Figura 1.33. Modelul molecule ce are, drept consecintS, cre§terea mobilitStii pSrtii ei seevential de fixare lSuntrice. §i denaturarea tennica prezintS date ca pentru un §ir de a Sllh'
enzime inactivarea este antecedents modificSrilor confonnatiei, care este indusS de T inaltS. Pierderea activitStii enzimatice in acest caz nu e provocatS de efectul inhibitorilor. Posibil cS enzimele oligomere (creatin kinaia), disociind la monomeri, ar putea sS se inactiveze in lipsa vSditS a desfa§urSrii moleculei enzimatice. Observatiile denotS cS disocierea creatin kinazei are loc la concentratii ale agentului denaturant, cu mult mai majore decit ale celor ce provoacS inactivarea enzimei.
Studiile actuale deinonstreazS cS mic§orarea activitStii enzimatice in conditii de concentratii relativ mici ale agentilor denaturanti sunt cauzate nu de efectul lor inhibitor sau de disociatia enzimelor oligomere, dar de dependenta deperturbarea confonnatiei centrului activ.
Datcle experimentale elucideazS cS centrele active ale majoritStii enzimelor sunt situate in regiuni ale moleculei mult mai mobile (intre domenii) §i deci sunt mult mai sensibile la actiunea agentilor denaturanti sau a factorilor fizici. In confonnitate cu ipoteza “potrivirii induse" a lui D.Koshland, in fiecare fazS a ciclului catalitic regiunea centrului activ capStS o confomiatie specifics fazei. Activarea enziiuei este rezultatul coaptSrii CA a confonnatiei, perfecte, ce detenninS efectul catalitic maxim. Darin caz de sporire a activitStii enzimatice la incSlzire §i proteolizS, are loc trecerea dintr-o conformable compacts §i stabilS in alta relativ mai deschisS $i structuratS mai fin. La proteolizS limitatS activarea zimogenului e cauzatS nu de coaptarca CA a confonnatiei perfecte cu tnodificSri fine in trecerea de la conformatia zitnogcnului la cea neccsarS pentru catalizS, dar de majorarea mobilitStii moleculei proteice in regiunea CA. Anume flexibilitatea, dar nu structure bine formats a centrului activ, e responsabila pentru fiinctia catalitica.

SPECIFICITATEA ENZIMELOR

Cea mai importanta prioritate a enzimelor e inalta lor spccificitate dc actiune - atribut fundamental cc detennina succesiunea reactiilor care favonzeaza calea metabolica.
Multitudinea formelor de manifestare a spccificitatii poatc fi incadrata in 2 catcgorii - cea de reactic ?i de substrat.
1. Specificitatea de reactie estc proprietatca de a cataliza un anumit tip dc reactic ce sta la baza clasificarii enzimelor. Enzimele proteolitice catalizeaza hidroliza legaturilor peptidice:
O O
H2N—CH— C-i-NH— CH—C-i-NH—CH—COOH + 2H20 —►
“ I ' I ' I
R | R2 R2
H2N—CH—COOH + H2N—CH—COOH + H,N— CH— COOH
- 1 • 1 • 1
R i R2 R2
Multe enzime catalizeaza §i hidrolizeaza legaturile esterice, reactia fiind asemanatoare.
R,—C—0-R2 + H,0
II
O
R —C—O + R2-OH
on
Unele enzime au 2 zone distincte in structure lor proteica, fiecare responsabila pentru un anumit tip de reactie specifica.
2. O enzima cu 0 anumita particularitate de reactie poate asigura transformarea corespunzatoare a unui grup dc substantc inrudite chimic — specificitate relativa, sau reactia se resfringe asupra unui substrat—specificitate absoluta. Dreptexemplu de specificitate absoluta pot servi anhidraza carbonica, ureaza, ultima reprezentind o enzima ce catalizeaza unnatoarea reactie:
H2N—C—NH2 + H70 — CO, + 2NH3
H
O
Specificitatea relativa se manifesto in diferite ipostaze:
a) poseda o arie larga, fata dc numarul substraturilor (protcazele in functie de rcsturi de aminoacizi: chimotripsina — legatura peptidica, formata de COOH a Phe, Tyr, Tip; tripsina - de COOH ai Lys §i Arg; trombina —dcCOOH ai Arg $i NH^ai Gly);
b) fonrieaza 0 arie mai ingusta: alcool dehidrogenaza — dehidrogenaza un grup de alcooli monohidroxilici cu un numar mic de atomi de C (specificitatea de grup), adica se manifests prin gi-uparea chimica:
ADH
R-CH2-OH^^ r ch=o
NAD+NADH+ H +
-61 -
c) in lipazele digestive specificitatea coreleaza cu pozitia legaturii esterice intre glicerina §i acizii gra§i:
0
II
CH2-0—C-R,
Lipaza pancreatica
ch2-oh
1
ch-o-co-r2
CH—0—CO—R
ch2—o—c— r3
II
0
2H2° r,-COOH
ch2-oh
R3-COOH
n
E
to
1
0
33
Lipaza in test in a la
tt n >
2 R,- COOH
CH—OH
ch2-oh
Stereospecificitatea de substrat §i de reactie
Majoritatea biomoleculelor poseda un atom de C asimetric §i, bind chirali, pot exista sub forma celor 2 enantiomeri. O enzima ataca numai un izomer—stereospecijicitate:
a) in toate reactiile glicolitice enzima corespunzatoarc actioncaza asupra esterilor fosforici ai D-hexozelor ?i D-triozelor; se utilizeaza numai L-aminoacizii; in aceste cazuri substratul optic activ se transforma in produs care poate fi sau nu optic;
b) cind substratul este inactiv optic, dar este produsul optic al reactici, sc considera ca reactia este o “sinteza asimctrica’ Aceea§i situatie sc observa §i in activitatea tumarazei, SDH, LDH:
H3C— CH-COOH
I
OH
LDH
NAD" NADH+ H
h3c-
COOH
L-acid lactic
Acid piruvic
c) enzimele catalizeaza transformarile doara unui singur izomer -cis sau trans;
d) pentru a utiliza ambii antipozi optici, organismul dispune de racemaze (epimera- ze), care transforma un izomer in altul:
D-alanina —L-alanina
Utilizindu-se substraturi marcate cu izotopi radioactivi, s-a constatat ca unele enzime sunt capabile sa diferentieze doua grupc chimicc identice.
Glicerol kinaza fosforileaza asimetric glicerolul, estcrificind aceea§i grupa de alcool primar:
'ch2— oh
2CH - OH 3 CH2 OH
E
ATP ADP
1 CH?—OH 2CH—OH
3ch2—o—P03
- 62-
Enzimelor le sunt proprii manifestSri absolut spccifice, anumite substraturi. Ele accelereazS diverse reactii chimice, fara formarea produsclorauxi Hare. Moleculelc substratului trebuie sS posede anumite particularitati stmeturale de baza:
a) substratul confine o legSturS chimicS specifics pe care enzima o scindeazS;
b) substratul trebuie sa posede o anumita grupS functionals, grupa de legatura, care jonctioneazS cu enzima ?i oricnteazS moleculele substratului in ccntrul activ. Cu alte cuvinte, legatura chimica a substratului trebuie sa ocupe o pozitie adeevata fata de grupa cataliticS a enzimei.
Ce mecanism de accelerare a vitezei reactiei chimice poseda enzimele?
Pentru a pStrunde acest mecanism, e necesara con§tientizarea unor notiuni ca: ener- gia de activare exprimatS in calorii, energie necesara tuturor moleculelor unui mol de substantS, care la o anumita temperature sa atinga starea de tranzitie corespunzStoare apexului barierei energetice. Factorul ce asigurS desfa§urarea reactiilor in organismele vii la T°C interna constants este delimitarea la valori minime a energiei de activare. Viteza reactiilor e dependents de diferenta valorilor de energie libera (aG) pentru starea A (s) §i complexul de tranzitie. Ea este egala cu: aG = Gst - Gs. Se mai nume§te energie libera de activare — Gibbs.
Viteza reactiilor e proportionals cu numSrul de molecule, a cSror energie liberS este egalS sau mai mare decit aG. O datS cu cre§terea T,numarul moleculelor spore?te de 2 ori la 10° C. Enzimele accelereazS viteza reactiilor chimice (VRC), mic^orind bariera de activare, $i reactia decurge dupS alt mecanism, ce se caracterizeazS printr-o energie de tranzitie mult mai micS (fig. 1.15).
Formarea §i scindarea legSturii chimice de enzimS e precedatS de formarea complexului enzima-substrat [CES]. Substratul e fixat de o zonS restrinsS in enzimS, specifics,denumitS “centrulactiv”al enzimei. A§adar, ccntrul activ (CA) e o imbinare in tirnp $i spatiu a anumitelor grupe functionale, ce intra in legatura cu moleculele substratului $i determind activitatea catalitica a enzimei.
Dispunem de numeroase investigatii experimentale ce vizeazS formarea complexului enzima-substrat (CES):
1.Investigatii demonstrative prin intermediul microscopiei electronice ?i al analizei roentgenostructurale.
2. Formarea CES e insotitS
de modificSrile fizice ale enzimelor: solubilitate,
teimolabilitate.
3. Se modifies ?i caracteris- tica spectroscopicS, dacS in componenta enzimei intrS grupe prostetice colorante.
Figura 1.15. Diugruniu ce repreziitta energia libera de activare in reactiile chimice: S-substrat A; P-produs final B; ES $i EP- compuf intermcdiari.AGo - energia de reactie standard S~*~P
- 63-
4. Adecvata e §i metoda rezonantei electronice de spin (RES) sau rezonantamagnetica nucleara (RMN).
5. La formarea CES se manifests un grad mare de stereospecificitate (D - aminoacizii nu pot servi ca substraturi, nu se leaga cu enzima). Zona de legSturS are o formS geometries bine conturatS (fig. 1.16).
6. Uneori afinitatea mare a enzimei cu substratul A (in lipsa B) inlesne§te stabilirea complexului EA.
7. La concentratia constants a enzimei viteza reactiei spore§te o data cu mSrirea concentratiei de substrat, ajungind la viteza maxima.
In 1913, L.Michaelis a explicat notiunea de viteza maxima a reactiei fermentative fata de formarea CES. Concluzia ca viteza reactiei devine maxiina la concentratia mare a substratului, in conditiile in care acesta ocupa toate centrele active ale enzimei, e o argumentare inradacinata demult §i o dovadS Figura 1.16. Fixarea substratului in centrui concludentS a functionary complexului activ al cl"motr'Ps,"e‘ enzima-substrat.
Unele particularitati ale centrului activ (CA)
Centrui activ este alcatuit dintr-un “centru de legare” ?i un “centru catalitic”. Mai exact, in centrui activ unele grupari (sau resturi ale aminoacizilor) sunt implicate in legarea substratului, altele asigura cataliza propriu-zisa, fund “intercalate” ca grupe catalitice.
Enzimele confera o varietate structurala destul de mare, la fel de vaste sunt specificitatea $i mecanisinul actiunii catalitice. $i, totu§i, rezulta unele concluzii generale, referitoare la proprietatile lor:
1. CA ocupa o parte relativ mica din volumul enzimei §i majoritatea din restul aminoacizilor moleculei de enzima nu contacteaza cu substratul. E o enigma solicitarea unor dimensiuni atit de mari de catre enzime.
2. CA e o structure tridimensionala (nu e doar punct, linie sau plan) — structure complexa, la formarea careia participa grupe ale diferitelor resturi de aminoacizi (exemplu: instiucturalizozimului,dincei 129 de aminoacizi radicalii aminoacizilor din secventa liniara — 35,52,62,63,101 participa la formarea CA). Centrele active ale unor enzime sunt redate Tn figurile 1.17-1.18.
-64
Figura 1.17. Centrui activ al chimotripsinei
3. Substratul relativ slab se leaga cu enzima. Energia libera a interactiunii e de
3-12kcal/mol. Forta legaturilor covalente nu deviaza de la li mi tele 50-110 kcal/mol.
4. CA are forma de “adincitura” sau “cavitate” (§ant, despicatura), unde apa n- are acces, cu exccptia daca aceasta scrve?te drept reagent al reactiei. Aceasta cavitate confine citiva aminoacizi polari ce exercita legarea §i cataliza. Regiunca CA are un caracter nepolar ce favorizeaza fixarea substratului. De mentionat ca forma CA creeaza un microspatiu, in care resturile polare capata insu§iri deosebite, necesarc pentm cataliza.
5. Fixarea specifics e dependents de pozitia bine dcterminatS a atomilor in CA.
Substratul pStrunde in CA, cu conditia similitudinii de forma. In 1890, Emil Fischer a elaborat modelul “clasic” al structurii spatiale a CA in raport cu structura substratului. Anume acest principiu—' ‘lacat
-cheie” — a contribuit cu succes la evolutia conceptului catalizei stereospecifice (fig. 1.19).
Figura 1.18. Centrul uctiv al elaslazei
+
Figura 1.19. Formarea complexului enzima- substrut (ES) dupa modelul E. Fischer
In ultimii ani insa s-a constatat ca centrul activ nueo structura rigida cum presupunea E.Fischer, ci se modifica la fixarea substratului. Modeluldinamic, propus de D. Koshland, presupune o flexibilitate a zonei de cazare a CA in enzima libera. CA este preformat, ceea ce denota ca are o conformatic spatiala putin diferita de cea necesara fixarii substratului. Substratul induce o “modificarc conformationala” a zonei CA, realizind o configuratie optima fixarii (fig, 1.19a).
Unele enzime fixeaza substratul in forma lor tensionata, ce corespunde starii detranzitie.
Din punct de vedere termodinamic, situarea cea mai potrivita a substratului in raport cu enzima reduce la mi ni m gradele de libertate ale transiarii §i rotatiei substratului, ii mic§oreaza entropia, ceea ce favorizeaza obtinerea efectiva a starii de tranzitie §i motiveaza in mare parte scaderea energiei de activare a reactiei catalizate enzimatic.
E incontestabil faptul ca flexibilitatca stmeturii enzimei determina prezenta substratului in sfera de actiune a grupelor catalitice §i iesircaprodusului din acest sistem.
Figura 1.19a. Modificarile conformationale in molecula enzimei !a fixarea substratului (modelul D.Koshland)
-65-
Unele enzime indue o perturbatie a electronilor pe substrat, amplificind cu mult viteza catalizei (carboxipeptidazS).
Exists o varietate mare de factori ce influenteazd viteza reactiilor fermentative $i determina activitatea cataliticd a enzitnelor.
1. Concentratiafermentului:
a) in conditii standard, 2 molecule de enzime intr-o anumita perioadS de timp vor cataliza de 2 ori mai multe molecule de substrat decit o moleculS de enzimS V = R[E] — o relatie strict proportionals. La mSrirea concentratiei de enzima se observa devieri de la relatiile strict liniare—devieriimaginarece tin de metoda de studiu;
b) in prezenta mai multor enzime, viteza va fi limitatS de concentratia uneia dintre ele;
c) o data cu sporirea concentratiei enzimei, viteza unei reactii complexe se va mic$ora in cazul in care coenzima practic va fi legatS de o enzima inaccesibilS pentru celelalte;
d) adaosurile toxice pot fixa enzima. Numai dupS legarea lor, enzima va deveni aptS pentru activitate.
2. Concentratia substratului. Concentratia enzimei din tesuturi suportS variatii mici in timp (cu exceptia enzimelor “inductibile”), astfel incit ea poate fi considerate constants.
In schimb, concentratia substratului poate varia destul de mult conform stSrii metabolice a tesutului. Dependenta vitezei reactiilor de concentratia substratului constituie aspeclul cel mai important alcineticii enzimatice (fig. 1.20). Vo(nM/min)
Reprezentarea grafica reflects o 1 V|na^S^ V =V_
curba cu afinitati de hiperbola.
Explicarca ei se datoreazS lui L.Michaelis §i M.Menten. KM cste egalS cu concentratia substratului pentru care Vo prezintS ojumatate din Vnnx. Exprimarea KM se face in unitSti de concentratie §i se deduce din presupunerea de bazS precum cS factorul-limitS al vitezei reactiilor fermentative este scindarea complexului ES in produs §i enzimS.
Fiecare enzimS in parte are valoarea Km pentru substratul dat. Unele enzime (catalaza, carbanhidraza) cer cantitSti relativ mari de substrat pentru a atinge viteza egalS cu Vo; altele (hexokinaza) ating mSrimea datS la concentratii mici de substrat.
In conditiile de mediu al celulei, enzima nu-i saturatS cu substrat si nu functioneazS cu V Modificind concentratia
T * max. ’
substratului, c posibilS, in anumitS mSsurS, reglarea proceselor oxidative dincelulS.
3. pHoptim al fiecarei enzime, ce genereaza o actiune maxima a ei, nu coincide obligatoriu cu valorile pH caracteristice mediului intracelular al enzimei.
Figura 1.20. Variafiile vitezei reactiilor enzimatice in functie de concentratia substratului
Ecuatia lui Michaelis-Menten.
V [S]
max1- J
V =-
Km + [S]
- 66-
Marind sau mic§orind pH-ul mcdiului, se poate regia activitatea catalitica a enzimelor. Acest optim pH e dependent de gradul de ionizare a grupelor functional, al afinitatii enzimei cu substratul §i stabilitatii ei (fig. 1.21).
Ionii H+ ?i OH' au un efect denaturant asupra enzimelor — rup legaturile, ce determina structura tertiara. Daca in CA al enzimelor se afla grupari ionizabile, acide sau bazice, acestea interactioneaza direct cu ionii H+ §i OH;, rezultind cre§terea sau scaderea gradului lor de disociere §i actionind ca adevarati inhibitori ai enzimelor (amilaza in sucul gastric).
4. Influenta temperaturii (T) determina stabilitatea §i viteza de scindare a complexuluiES, influentindafinitatea enzimei la substratul activator sau inhibitor. Cre§terea vitezei reactiei o data cu cre§tcrea temperaturii este interpretata prin prisma “energiei de activare”. Pentru fiecare enzima se poate stabili o temperature optima, viteza atingind valoarea maxima. Cre§terea temperaturii cu 10°C pina la 40°C dubleaza in continuare viteza reactiei. Viteza scade din cauza distructiei enzimei, iar temperature inactivatiei enzimei coincide cu punctul de denaturare a proteinei (fig. 1.22).
Figura 1.21. Activitatea unor enzime in dependenta depH
Figura 1.22. Efectul temperaturii asupra activitatii enzimelor

ENZIMELE

Istoriabiochimieieste, in primul rind, istoria studicrii enzimelor—celormai distinctive §i specifice protcinc cu proprietati cataliticc.
Enzimologia e demult considcrata o §tiinta apartc 51 s-a dezvoltat efectiv in ultima perioada de timp, dar inceputurile ei se atesta din primele deccnii ale secolului al XIX- lea.
Dacain 1920 erau estimate 10-15 enzime prin observarea efectului actiunii lor, astazi sunt caracterizate partial peste 2000 enzime, dintre care circa 500 au fost obtinute sub forma unorpreparate perfect purificate (unele cristaline) §i studiate din punct de vedere fizico-chimic §i biologic.
Manifestable actiunii enzimelor (fermentatia, digestia) erau cunoscute de loarte mult timp, dar explicatia mecanismului accstorproccsccomplcxe, rolul §i locul enzimelor in transformable substantelor cclularc ramineau neelucidate. Un $ir de mecanisme sunt §i pin! astazi nedefinite.
Definitia enzimei s-a conturat atunci cind s-a observat c! in sistemele biologice au loc procese catalitice survenite din extractele de orz germinal ce realizeaza hidroliza amidonului. Cu ajutorul precipitarii repetate cu alcool etilic s-a obtinut (1833) 0 pulbere alba — extrem de termoiabila—diastaza (din grece§te didotabis - separare).
In perioada 1834-1837savantulsuedez J.Berzelius formuleaza conccptul dc cataliza, conform camia un catalizator mare?te viteza reactiilor chimice §i rezulta la sfinjitul lor nemodificat—cantitativ §i calitativ. El sugereaz! ca diferitele fenomene biologice (fermentatia, digestia) pot fi explicate prin prezenta unor catalizatori biologici specifici materiei vii. In 1860, L.Pasteur stabile§te ca fennentarea zaharului de drojdii in spirt e catalizat! de “fermenti organizati indispensabil de organismele implicate in procesele fennentative”.
Aceasta concluzie era in contradictie cu postulatul lui J.Liebig, care considera ca femientul e solubil, fiind produs de celula vie §i nu constituie celula propriu-zisa.
inanul 1877, W.Kuhncpropunetermenulenzima(de la grecescul enzyme — “in drojdii”) pentru atare grupa de substante. O fierbere aparenta cauzata dc “fcmicnf ’ (in latinafervere—a fierbe), cu degajarca CO, in proccsul fermentativ, caracterizeaza aceste fenomene biologice.
Cclebra disputa $tiintifica Pasteur—Liebig a fost finalizata cu brio in 1897, de catre H. §i E.Buchner, care au demonstrat ca sucul cclular al unei culturi de drojdii conservcaza intreaga activitate fennentativa, proprie acestui microorganism.
In ultimii ani ai sec.XIX, E.Fischer, efectuind studii asupra unor enzime hidrolilice, a specificitatii enzimelor, elaboreaza teoria interactiunii enzima-substrat. Aceasta teorie a stimulat cercetarile in acest domeniu.
Epoca modern! incepe o data cu izolarea, purificarea §i cristalizarea primelor enzime. In 1926, J. Sumner a cristalizat ureaza §i a detenninat ca cnzimele totalmcnte sunt de natura proteica. El inainteaza conceptul ca toate enzimelc sunt protcinc, dar savantul german Richard Wiilstiitter, 0 adevarata somitate in materie, conllnna ca cnzimele sunt substante cu o greutate molecular! mica, iar proteina depistat! e o sitnpl! murdarie.
-58-
Mai tirziu, J.Northrop, impreuna cu colaboratorii sai, cristalizeazapepsina §i tripsina, confirmind astfel ca §i ele sunt proteine. A§adar, natura proteica e stability incontestabil. S-auinceputstudii intensive in acest domeniu, ceaudatrezultateremarcabile. Cutoatc acestea, o serie de intrebari, cum ar fi: dc ce proteinelejoaca rol de catalizatori; care estc cauza ca molccula enzimeiemultmaimaredecitasubstratului; decc aminoacizii nu poseda proprietati similarc, dar unite in lant polipeptidic capata proprietati catalitice; in ce mod are loc reglarea activitatii enzimelor—toate a§teapta raspunsuri explicite.
Ce sunt enzimele?
Enzimele sunt unitati functional ale metabolismului celular. Actioneaza strict intr-o anumita consecutivitate. Catalizeaza sute de reactii in lant, finalizind cu eliberarea moleculelor din substante nutritive. Encrgia substantelor rcagente trece dintr-o forma in alta cu o cficacitate mare §i se acumuleza in ATP cc csteutilizat in proccscle vitale.Din micile biomolecule se asambleaza macromoleculele celulei.
O grupa deosebita sunt enzimele reglatoare, care sesizeaza difcrite semnale perfect metabolice $i, respectiv, i§i modified activitatea catalitica. Datorita acestor enzime in celula totul e coordonat: c garantat un echilibru armonios dintre procesele metabolice necesare pentru mentinerea integritatii §i, in final, a victii celulelor, viabilitatii sistemului §i al intrcgului organism.
Insuficienta sau lipsa completa a unuia sau a mai multor fermenti duce la aparitia diferitelor afectiuni ereditare; difcrite stari patologice apar la o activitate excesiva a uneia sau a mai multor enzime. $i o data cu elaborarea unui preparat mcdicamentos care ar regia activitatea acestor enzime, vom trata eficient boala.
Enzimele joaca un rol important la stabilirea diagnosticului, detennmind activitatea lor inlichidul biologic. In industria chimica §i alimentara evaluarea enzimelor este utilizata pc larg. Enzimele au un rol aparte §i in agricultura.
Structura enzimelor
Enzimele sunt proteine §iposeda toate proprietatile fizico-chimice specifice acestor macromolecule (solubilitate, proprietati osmotice. sarcina electrica ncta, denaturare tennica, reactii chimice etc.). Activitatea lor e dependents dc pastrarea structurii native a proteinei. Confirmarile experimentale ale acestui postulat sunt:
1. Distmgerea lantului polipeptidic prin fierbere in solutii acide sau prelucrarea lui cu tripsina ducc la picrdcrca activitatii catalitice. Pentru mentinerea ultimei e necesara pastrarea structurii primare.
2. Modificarileinimpachetarea lantului polipeptidic (incalzind proteina sau actionind cu pH de valori extreme, cu agenti denaturanti) cauzeaza pierdcrca activitatii catalitice, ccea ce indica necesitatea mentinerii structurii secundare $i tertiare a proteinei.
Masele moleculare ale enzimelor variaza in limite foarte largi. Ribonucleaza are o tnasa moleculara egala cu 13700Da. Limitasupcrioaraestegreudedcfinit. Numeroase enzime sunt alcatuite nurnai din resturi de aminoacizi unite intre cle prin iegaturi covalente, peptidice §i nu doar printr-un lant, ci prin mai multe lanturi polipeptidicc.
Unele enzime sunt asociate cu compusi dc mase moleculare mici, dializabili. Cind ace?ti compusi organici sunt strins legati in structura enzimei, ei poafia denumirca dc grupariprostetice, insa cind imbinarca lor este usor disociabila—coenzime.
- 5 9 -
Ace§ti biocatalizatori se numesc holoenzime, iar componcnta protcica—apoenzime. Pentru totalitatea compu§ilor neproteici din structura heteroenzimelor se utilizeaza termenul cofaclor. in calitate de cofactori apar frecvent cationii unor metale §i foarte rar unii anioni. Un numar relativ redus de cofactori, de coenzime in asociere cu diferite apoenzime dau na^tere unui numar foarte mare de heteroenzime. Se atesta sute de dehidrogcnaze cu coenzimaNAD". Datorita legaturilor foarte slabe intreNAD" §i diverse apoenzime, un numar mare pot actiona simultan intr-un compartiment celular, utilizind o cantitate neinsemnata de coenzime. $i in aceste situatii este absolut necesar ca procesele de redu- cere sa fte echilibrate cu reoxidarea lor.
Ce e comun §i ce e distinct la cataliza enzimatica §i cea chimica?
Enzimele sunt catalizatori §i respecta legile catalizei:
I. Enzimele accelereaza viteza reactiilor chiinice posibile din punct de vedere termodinamic, determinind o scadere a energiei de activarc §i conducind la instaurarea mai rapida a starii de echilibru; accelereaza reactiile in ambele directii in mod identic A B.
In lipsa enzimei viteza (A —► B) e egala, dc exemplu, cu 10"* see., reactia inversa (A — B)decurgein 1 O'6 sec.
Constanta acestei reactii este egala:
Cd
x-----
Ci
= 100
in stare de echilibru concentratia substantci B este de 100 ori mai mare decit a substantci A, chiar daca c prezenta sau nu enzima. In lipsa enzimei echilibrul se stabile§te timp de citeva ore, iar cu enzima—in citeva secunde. Enzimele accelereaza aparitia echilibrului chimic in reactia catalizata.
2. Viteza reactiei create de milioane de ori. De exemplu, reactia catalizata de
carbanhidraza: C02 + H,0 H2C03
Fiecare molecula de enzima hidrateaza in 1 sec.- 105 molecule dcCO, §i, prin unnarc, viteza reactiei in prezenta enzimei create dc 107ori.
Efectul cnzimelor e extraordinar in comparatie cu cel al catalizatori 1 or sintetici. Enzimele seprezintain concentratii extremde mici la concentratii de substratrelativ man. Eficienla catalitica a enzimei este net superioara celei inregistrate in cazul catalazei chimice, exprimindu-sc prin numarul de turnover — numarul de molecule ale substratului transformat intr-un minut de o molecula de enzima.
3. La sfir^itul reactiilor chimice enzimele, la fel ca §i catalizatorii, se regasesc, din punct dc vedere cantitativ $i calitativ, intr-o stare chimica neschimbata, participind la un nouactcatalitic.
4. Enzimele sunt substante macromoleculare extrem de instabile, reactionind in conditii optime numai la iinumiti parametri - parametri optimi de actiune a enzimei — solutii apoase diluate, pH valorii fiziologice, T anumita §i presiune adeevata.

PROPRIETATILE GENERALE ALE PROTEINELOR

Proteinele sunt compu$i macromoleculan cu proprietati hidrofile, adica sunt solubile. Aceasta inspire se datoreaza repartizarii pe suprafata moleculelor a resturilor de aminoacizi cu sarcini electrice sau a grupelor polare. Proteinele fibrilare sunt insolubile in apa, pe cind cele globulare atesta grade diferite de solubilitate.
Solubilitatea proteinelor
Solubilitatca in apa este putemic influcntata de diverse sarari ale metalelor u$oa- re: NaCl, MgCl,, Na2S04, (NH4)2S04. In concentratii mici ele au un efect favorabil. De exemplu, globulinele sunt greu solubile in apa pura §i se dizolva u?or numai in solutii saline diluate. Efectul nu depinde de natura sarii, dar de concentratia ei §i de numarul de sarcini ale fiecarui ion din solutie. Mai eficace sunt sarurile ce contin ioni bivalenti (Mg), fata de cele ce au ioni monovalenti. Solubilitatea marita e determinate de cre$terea gradului de disociere a gmpelor ionizate in proteine.
In concentratii foarte mari sarurile amintite reduc solubilitatea proteinelor pina la precipitarea lor din solutie - salifiere. Procesul e mai efectiv in punctul izoelectric al proteinelor. Mecanismul e complicat: ionii de sare atrag moleculele de apa polarizata, mic§orind cantitatea de apa ce interactioneaza cu proteina, cauza fiind concentratiile mari de sare in care numarul ionilor este imens fata de numarul grupelor cu sarcina a proteinei. Dar avind in vedere ca solubi 1 itatea proteinelor in apa este dependents de foirnarea membranei apoase in jurul grupelor ionice hidrofile, transferal molecular de apa la alti ioni mic§oreaza solubilitatea proteinei. Procesul decurge mai rezultativ atunci cind toate operatiile se efectueaza la temperaturi joase, in conditiile in care proteinele sunt mai stabile.
Diferite proteine se salifieaza la diferite concentratii de sarari — fenomen ce este utilizat pentra fractionarea lor. Globulinele precipita cind solutiile care le cuprind sunt aproximativ semisaturate in (NH4)2S04, pe cind albuminele precipita la concentratii mai mari — de 75% saturatie.
Procesul de salifiere a proteinelor in multe cazuri nu e legat de pierderea capacitatii proteinei de a se resolubiliza dupa inlaturarea agentului. Eliminarea prin dializa a (NH4)2SO, sau Na - sulfat complet conduce la resolubilizarea in apa a proteinei salifiate cu formarea solutiilor adeevate. Capacitatea de resolubilizare rapida se mentinc §i in cazul inlaturarii imediate a proteinei de la salifiat (alcool): proteina i$i pastreaza proprictatile native.
Solutiile in apa a proteinelor au un caractcr coloidal. Diametral unor astfcl de particulc e de la 1 la 100 nirac. Remarcam solutii reale:
a) ionice—particulclc sunt mai mici decit 1 mmc, disociaza in ioni, conduc curentul electric;
b) moleculare—se descompun pina la molecule, nu disociaza $i nu conduc electricilatea (glucoza, alcoolul)—dau spatiu optic nul.
Daca particulelc sunt mai mari de 100 mmc §i substanta famine solida in faza lichida, rezulta suspensia, iar cea lichida in lichid - emulsie.
Pentra solutiile coloidale (dar proteinele formeaza solutii coloidale) e caracteristic:
a) fenomenul lui Tindal pozitiv;
-49-
b) nu difundeaza prin membrane semipermeabile, care u§or transfera apa sau substantele micromoleculare. Procesul e numit dializa §i sta la baza functionarii aparatului rinichiului artificial. Majoritatea membranelor biologice normale nu sunt penneabile pentru proteine;
c) substantele ce fonneaza solutii coloidale nu se crislalizeaza la marirea concentra- tiei, dar gcncrcaza precipitat amorf. Proteincle pot fonna cnstale numai in anumite conditii, din solutia-mama;
d) solutiile coloidale au o viscozitate marita ce depinde de masa §i fonna mole- culelor. Proteinele de aceea§i masa moleculara, dar cu molecule asimetrice, au o viscozitate mult mai mare. Substantele coloidale interactioneaza cu apa. In proteine gmpele ionogenice leaga apa: COOI I - 4 molecule de H20, NH2- 3 molecule, OH §i NH - cite 2 molecule;
e) viteza de difuziune e foarte mica. Difuzia este procesul sumar de transfer al moleculelor dizolvate sub influenta gradientului de concentrate. Coeficientul de difuzie depinde de marimea §i forma moleculelor, de rezistenta determinate de vis- cozitatea solventului. Procesul de difuzie constituie baza functionarii celulei, transferului de substante. Viteza difuziei §i distanta la care pot fi transportati diferiti metaboliti in celula sunt parametrii principali ce limiteaza metabolismul in celulele vii §i organitele lor;
f) solutiile coloidale in concentratii rnari au o presiune osmotica mica. Ea depinde de numarul particulelor dizolvate in unitate de volum, dar nu de natura lor;
g) au tendinta de a forma diferite complexe moleculare;
h) sunt capabile de absorbtie §i singure se supun absorbtiei;
i) se tumefiaza §i se coaguleaza.
Solutiile coloidale capata fonna de sol — solutie lichida cu o anumita fluiditate §i compozitie de gel, pierzindu-§i fluiditatea dm cauza formarii stmcturii de retca interna cu fixarea apei. Atare structuri apar: 1) la tumefierea xerogelului (agar-agar, clei, gelatina);
2) in unna polimerizarii fibrinogenului; 3) in urnta condensarii amidonului, gelatinei.
La invechirea gelului are loc sinereza, proces de expulzare a apei datorita contractiei structurilor fonnate din particulele coloidale §i eliminarea solventului imobilizat. Apa inclasa in reteaua structurala e numita imobilizata, pe cind apa structurala e legata de gmpele hidrofilc interne ale macromoleculei protcicc. Sinereza are loc la coagularea singelui, in procesul de retractie a cheagului.
Proprietatile electrochimice
Proteinele sunt amfoliti macromoleculari, inglobind un numar redus de grupari acide si bazicc. Contributia cea mai importanta o au resturile de glutamil, aspartil, lizil, arginil §i histidil. Resturile aminoacide de la capetclc C ?i N tenninale nu au o inlluenta semnificativa, mai ales cind lantul polipeptidic este mai lung. Gmpele ionizate suntdispuse in interioml suprafetei moleculare.
Proprietatile acido-bazice sunt determinate de numarul mare de gmpe ionizate ale resturilor de aminoacizi. De predominarea lor depind proprietatile electrice. In albumina exista 109 rcsturi de COOI I §i 120 de NH,; hcmoglobina contine 48 COOH §i 48 NH,. Sarcina clectricac determinata de stmeturaproteinei.
Moleculele proteice, Hind electroliti amfoliti, interactioneaza cu acizii §i cu baz.ele,
-50-
participa la mentinerea pH. In intervalul 6-7 al pH capacitatea-tampon a proteinelor c foarte mica. Numai aminoacidul histidina poseda proprietati tampon la valori normale ale pH. Hemoglobina (Hb) eritrocitclor, transferind O,, sc caracterizeaza prin continut evident de histidina, de aceea $i are Hb - aceste proprietati - tampon la pH = 7.
Particulcle proteice in solutie pot sa-s?i schimbe sarcina electrica in depcndenta de pH. In solutie acida are loc inhibarea disociatiei COOl I §i, avind sarcina pozitiva, protcina migreaza spre catod, in solutie bazica invers—spre anod.
R-COOH
|
NH2
+HC1
R- COOH
1
NH3C1
R-COOH IT R-COONa
+NaOH
NH2 NH2 +t
pH - solutiei, in care proteina apare cu o sarcina electrica nula, numarul gruparilor (+) este egal cu acela al gruparilor (-), este denumitpHizoelectric saupunct izoelectric (pi). Valoarea pi depindc de compozitia proteinei in aminoacizi. O proteina ce arc surplus de lizina §i arginina denota un pi >7, iar aceea care are o proportie mare de aminoacizi dicarboxilici - pi < 7.
R COO +H+ R—COOH R—COO +QH" R~ COO'
|+ —> 1+ 1+ —> I +h2o
nh3 nh3 nh3 nh2
in tabelele 1.4. §i 1.5. sunt date valorilc pi ale unor aminoacizi §i ale unor proteide. La pH izoelectric solubilitatea, mobilitatea proteinei in cimpul electric este minima; pentru fiecare protcina e caracteristic pi propriu. Valoarea lui e determinata de numarul de grupe ionizate §i de valoarea constantelor de ionizare (ribonucleaza—7,8; citocromul — 10,6; pepsina—1,0). in pi molecula proteicae cu sarcina nula §i intre moleculele invecinate nu apar forte electrostatice de respingere, ceea ce inseamna ca in atare conditii solutiile sunt nestabile.
5
Tabelul 1.4. Valorile punctului izoelectric pentru unii aminoacizi proteinogeni
Aminoacid
Pi
Aminoacid
Pi
Acid L-aspartic
2,77
L-Valina
5,96
Acid L-glutamic
3.22
L-Leucina
5,89
L-Cisteina
5,07
L-Izoleucina
6,00
L-Cislina
5,66
L-Glicocol
5,97
L-Tirozina
5,66
L-Alanina
6,00
L-Serina
5,08
L-Prolina
6,30
L-Fenilalanina
5,48
L-Histidina
7,59
L-Triptofan
5,80
L-Lizina
9,74
-51 -
Tabelul 1.5. Valorile punctului izoelectric pentru diferite proteide
Proteide
pi
Proteide
pi
Pepsina
1,0
Fibrinogen
5,5
Cazeina
4,6
Y - globulina serica
6,7
Ovalbumina
4,6
Hemoglobina
6,9
Albumina serica
4,9
Mioglobina
7,0
Ureaza
5,0
Chimotripsinogen
9,5
Insulina
5,4
Citocrom C
10,6
Miozina
5,4
Lizozim
11,0
Evident cS prezenta sarcinilor antipode pe segmentcle distantate ale particulelor cre- eazS conditii pentru o agregare rapidS cu formarea agrcgatelor mari. Acest lucru favori- zeazS precipitarea lor §i la asemenea valori ale pH au o solubilitate mica. Astfel de particularitate este caracteristicS mai ales proteinelor globulare.
La valori mai mici sau mai mari de pi toate moleculele au accea§i sarcina §i, ca rezultat, sc resping una pc alta, agregarea bind imposibila. A§adar, sarcina electrica e un factor stabilizant al solutiilor coloidale. In solutii supraacide sau suprabazice proteina nu va precipita chiar la fierberc, adica nici chiar atunci cind i$i va pierde proprietStile hidrofile. Se §tie ca unfactor stabilizator al solutiilor coloidale e membrana apoasd. Solubilitatea proteinelor e dependents de hidratarea moleculara a lor, adica a gmpelor ionizate. Apa, jonctionindu-se de pe suprafata moleculelor §i cuplindu-se sub o formS de dipoli, formeazS membrana apoasa care impiedica aditia, fuzionarea particulelor coloidale §i in punctul pi.
Apa specific orientatS In jurul grupelor hidrofile e numita apa legato §i se caracterizeaza prin :
a) dispunere mai compacts, cc o apropie dc un corp solid;
b) proprietati reduse dc solvent;
c) nu ingheata la temperaturi joasc;
d) constanta diclectrica estc cgalS cu 2,8, pe cind la apa obi$nuitS este de 8 (constan- ta dielectrics este forta de atractie a ionilor incarcati opus). Prin urmare, factor'd stabilizatori ai sistemului coloidal sunt sarcina electrica §i membrana apoasd.
Precipitarea $i denaturarea proteinelor
Pentru aplicarea acestor proprietSti ale moleculei proteice e necesar de a o lipsi anume de stabilizatori. Metodele sunt diferite. In medicinS ele sunt folosile pentru caracteristica cantitativS ?i calitativaa proteinelor, din component biologici: urinS, singe, exudatetc.
Inlaturarca sarcinii electrice se efectueaza prin aducerea proteinei la starea pi. DacS drcpt ion de precipitate se folose^te cationul, precipitarea e mai favorabila in solutie slab
-52-
alcalina; daca e folosit anionul, atunci solutia trebuie sa fie putin acida—pentru a aduce particulele coloidale in starea electroneutrd.
Membrana apoasS poate fi inlaturata cu ajutoml dehidratantilor (alcool, acetonS). Ultimii leaga apa. Dehidratantii au o constants dielectrics micS, mic§orind-o §i pc cea a solutiei. In consecintS, ei mSresc atragerea intre douS sarcini antipod, creind astfel conditii pentru formarea perechilor de ioni ce favorizeazS agregarea proteinelor.
Corpurile proteice constituie o confonnatie nativS §i posedS anumite calitSti fizico- chimice §i biologice in conditii normale ale T, pH etc. Conformatiile sunt extrem de fragile §i u$or perturbabile sub actiunea multor agenti, care afecteazS interactiunile covalente din continutul moleculei. Modificarile conformatiei native unice se nume§te denaturare, iar agentii care o provoaca — agenti denaturanti. Denaturarea e o particularitate a proteinelor.
La denaturare sunt lezate legSturile necovalente; agentii denaturanti nu afecteazS legSturile covalente, nu sunt lezate nici jonctiunile peptidice, nu se eliminS ami- noacizi. Structure primarS a proteinei rSmine neafectatS.
TrSsSturile caracteristice ale proteinei denaturate:
1) pierderea sau mic§orarea activitStii biologice;
2) mic§orarea solubilitStii;
3) schimbarea fomiei §i mSriinii moleculelor;
4) modificarea caracterului dispersiunii razelor Roentghen;
5) cre§terea rcactibilitStii unor grape (SH);
6) aparitia unor grape functionale anterior nedetenninate;
7) pierderea capacitatii de a se cristaliza;
8) scSderea capacitStii de rezistentS la hidrolizS;
9) capacitatea sporitS de a da reactii de culoare;
10) mic?orarea mobilitStii electrice.
Denaturarea este provocatS de diferiti agenti: temperature inaltS, sSrari ale metalelor grele care in concentratii mici produc denaturarea, coagularea proteinei. Proteina coa- gulatS din solutie se leagS $i se precipitS cu factoral nociv. Fenomenul e utilizat in practica medicals. La intoxicatie cu sublimat bolnavului i se administreazS lapte, ovalbumins in cantitSti mari. Proteina fonneazS, in ansamblu cu substantele toxice, un precipitat ce mic§oreazS absorbtia lui. In unele conditii proteina denaturatS poate rSmine in solutie, dacS aceasta este acidS sau alcalinS, chiar §i la temperature de 100°C. Precipitatul va apSrea la neutralizarea solutiei.
La o actiune de scurtS duratS §i la eliminarea rapidS a agentului denaturant e posibilS renaturarea proteinei cu restabilirea activitStii ei biologice. Denaturarea e ireversibila atunci cind se rap legSturile chimice, in special cele disulfidice inter- §i intracatenare.
In procesul de sterilizare are loc denaturarea teraiicS §i, in consecintS, insuficienta de timp sau de t° duce la generarea §i rSspindirea microbului etc.
Multc proteinc nu sc denaturcazS la sublimarc (liofdizare). Lotusi, uncle cnzimc i§i diminueazS activitatea. E necesar sS §tim cS exists substante ce pot impiedicadenaturarea, $i anume: solutia de glucide simpla saturata, alcooli multiatomi (glicenna), unii anioni organici (dodecilsulfat, unii acizi gra§i) etc. Pentru a evita denaturarea proteinele se izo-
- 53-
leaza. Ele se pastreaza la rece, in solutii concentrate de saruri §i la un pH anumit.
Metodele de identificare a proteinelor. Problema elucidat'd complete a structurii macromoleculare a proteinelor este una dintre cele mai actuale §i de o incontestabila important teoretica §i practica. Pentru determinarea masei moleculare proteice pot fi utilizate unnatoarele metodc: marimea presiunii osmotice, Constanta ultracentrifiigarii (proteinele sedimenteaza in raport cu marimea ?i masa lor); metoda difuziunii luminii (intensitatea difuziunii e dependents de numarul particulelor §i de masa lor moleculara); marimea difractiei razelor Roentghen, microscopia electronica; continutul unor elemente (in Hb concentratia Fe este egala cu 0,34%), care se contin in cantitati mici (in albumina sericS concentratia triptofanului e de 0,58%).
Masa moleculara _ Masa atoinului x 100 minima a proteinei Cantitatea elementului in %
Masa moleculara a albuminei (Trp)
204x 100
0,6
= 34000 Da
Masa moleculara a hemoglobinei (Fe)
2)6 X 100 = 16470 Da
0,34
Stabilirea structurii unei proteine incepe cu izolarea $i purificarea ei, determinarea masei moleculare, identificarea calitativa §i cantitativa a aminoacizilor componenti, modului lor de legare, secventa aminoacizilor, in fine, cu orientarea tridimensionala a macromoleculelor.
1. Proteinele se separa de celelalte componente prin dializa, utilizindu-se membrane semipenneabile. Pentru accelerarca procesului se aplica electroliza — electrodiaiiza.
2. Solutiile proteice se purifica, diferentiindu-se dupa marime §i forma prin filtrarea cu geluri speciale care fiinctioneaza ca site moleculare — moleculele de marimi mici se repartizeaza intre faze, iar cele mai mari nu patrund in faza interna. Moleculele asimetrice pot sa nu patrunda in faza interna. (Granulcle porozitate de gel sunt suspendatc intr-o solutie, formind 2 faze - una interna — in granule, §i alta externa—in afara lor). In cazuri apartc la purificarea unor enzime se pot utiliza §i alte metode. Se observa afinitatea lor cu diver§i ioni, grupe functionale — cromatografia de afinitatc (fig. 1.15 a,b,c).
a) Cromatografia prin schimbatori de ioni este bazata pe distingerea semnului §i sareinii electrice la pH-ul dat. Coloana matrice prezinta un polimer sintetic ce confine grupari fixate. La legarea gruparilor anionice matricea este schimbatoare de cationi, iar la fixarea gruparilor cationice—schimbatoare de anioni. Afinitatea proteinei pentru gruparile fixate in coloana este influentata de pH (starea ionizanta a moleculei) §i de concentratia ionilor salini din mediul respectiv. Separarea poate fi optimizata prin schimbarea succesiva a pH-lui §i /sau a concentratiei saline a fazei mobile.
b) Gel - filtrarea separa proteinele in dependents de dimensiuni. Matricea coloanei prezinta un polimer fixatce confine pori cu anumite marimi. Proteinele man migreaza mai
-54-
a)
Granule polimerice cu grupari functionate incarcate negativ
A mextecuI proteic este adaugat in coloana ce confine schimbatori de f|-" ' cationi •
;;
i?
Proteinele tree prin coloana la rata determinata de sarcina lor la pH-ul dat. Proteinele cu sarcina negativa tree mai repede fi sunt eluate mai rapid
I 1 a < 5 «
/"
Wf
Amestecul proteic este adaugat in coloana ce confine un ligand fixat la polimer, specific pentru proteina ce prezinta interes
Proteina ce prezintS interes este eluatd cu ajutorul solutiei ce confine ligand liber
.\foleculele proteice se separa in dependenfa de dimensiune: moleculele mai mari tree mai liber fi apar in fraefiile timpurii
Proteinele nedorite sunt spalate din coloana
Kigura 1.15. Metode cromatografice utilizede pentru puriftcarea protein el or:
a) cromatografia prin schimbatori de ioni; b) gel-filtrarea; c) cromalografia de afinitate
-55-
rapid dccit ccle mici (nu patrund in porii granulelor). Proteinele mai mici intrS in pori, sunt retinute, avind o cale mai lungS de traversat.
c) Cromatograjia de afmitate separS proteinele in dependents de specificitatea lor de legare. Proteinele retinute in matrice sunt fixate specific de liganzi prin legaturi transversale (termenul «ligand» se refers la o grupS sau o moleculS care se leaga de macromolecule de tip proteic). DupS eluarea proteinelor nefixate in coloanS, proteina legatS de interes particular este eluata prin intennediul unei solutii ce confine ligand liber.
in .'jtiinta contemporanS este pe larg utilizatS metoda elecroforezei (fig 1.16a). Diferite probe sunt introduse in rezervoarele ce contin gel de poliacrilamida. Proteinele tree in gel, unde este aplicat un cimp electric. Dupa citeva ore de la efectuarea elecroforezei, proteinele pot fi vizualizate prin tratarea gelului cu diferiti coloranti (albastru de metilen), care se fixeazS de proteine, dar nu la gel. Fiecare bands din gel reprezintS o proteina individuals. Proteinele mai mici migreazS mai rapid $i sunt depistate mai departe de baza gelului. in fugurS este ilustratS purificarea enzimei RNA polimeraza din E.coli. Prima bands corespunde proteinelor prezente in extractul cclular nativ.
NecesitStile $tiintifice impun utilizarea elecroforezei cu cromatografia verticals sau focalizarca izoelectricS — electroforezd bidimensionala.
in focalizarea izoelectricS (fig. 1,16b), tehnica modems permite separarea proteinelor in dependents de punctul lor izoelectric (tab. 1.5).
Un gradient constant al pH-lui este stabilit in gel prin adausul amfolitilor potriviti (1). Amestecul proteic este plasat intr-un rezervor in gelul la care se aplieS un cimp electric
(2) . Proteinele pStrund in gel $i migreazS pinS ce fiecare atinge pH-ul echivalent pi propriu
(3) . Amintim cS atunci cind pH este egal cu pi, sarcina nets a proteinei este egalS cu zero, in figurS sunt arState proteinele dupS coloratie, care sunt distribuitc dc-a lungul gradientului pH-lui in dependents de valoarea pi.
in electroforeza bidimensionalS (fig. 1.16c) proteinele initial sunt separate prin focalizarea izoelectricS intr-un gel cilindric. Apoi gelul este amplasat orizontal pe un alt gel in formS de placS, unde proteinele sunt separate prin elecroforezS in gel de
-56-
*
pi ..... *■
■»)©)
Focalizarea
izoelectrica
Mr
Electroforeza »
<->
« f * t
Gelul focalizat
I
izoelectric este
iii « » j
plasatin
........->
gelid de
W . . Pi
y-s poliucrilamida
4 .it
■ ;
®PSfe§|
Figural.16. c) elecroforeza bidimensionald
poliacrilamida. Separarca orizontala reflects diferentele de pi, iar cea verticals — masa moleculara. Utilizind aceastS tehnicS, pot fi separate mai mult de o 1000 de diverse proteine din E. coli.
Mobilitatea electroforetica a proteinei in gel de poliacrilamida poate fi utilizatS $i in determinarea masei moleculare (tig. 1.17).
Proteinele standarde cu masa moleculara cunoscutS sunt supuse electroforezei. Aceste proteine - marker (1.17a) pot fi utilizate pentru a estima masa moleculara a proteinelor necunoscute.
In (1.17b) este redata dependenta logaritmului masei moleculare a proteinelor marker versus migratiei relative la o electroforeza liniarS. Graficul respectiv pennite determinarea masei moleculare a proteinei necunoscute. La moment sunt cunoscute metode mult mai sofisticate de purificare ?i apreciere structural a proteinelor.
a)
1 2
©
-Ljr~Ljr
Miozina
200,000
fi-galactozidaza
116,250
Glicogen fosforilaza f}
97,400
(■■MM*
Proteina
Seralbumina
66,200
studiata
Ovalbumina
45,000
■
Carhanhidraza
31,000
—
Inhibitorul tripsinei Lizozimtil
21,500
14,400
—
©
Mt standard
Figura 1.17. Estimarea masei moleculare
-57-

CLASIFICAREA PROTEINELOR

Savantii M. Levitt §i C. Chothia (1970), examinind structura proteinelor, le-au divizat in 5 clase (ficcare clasa difera dupa prezenta §i pozitia oc-spiralei §i fi-structurii (fig. 1.14, a-h)):
I. Proteine ce contin 100% a-clice, formind o structura globulara.
II. Proteine ce contin (3-stmctura §i, de regula, sunt alcatuite din doua straturi antiparalele sau situate in forma de “butoia^e”.
III. Proteine ce includ atit a, cit §i (3 componente segregate in structura tertiara.
IV. Proteine ce inglobeaza ovf) segmcntc alternate in structura secundara, formind structura tertiara cu centrul (3 §i incercuite dc a-spirala.
V. Proteine neorganizate cu structura secundara evidential nesemnificativ. Plie- rea lantului este determinata in exclusivitatc de interactiunea radicalilor (coit pro- teic) - puntilor disulfidice. Acestea sunt proteinele mici.
Clasificarea sus-numita a fost desavir§ita de J.S. Richardson (1981).
A§adar, organizarca structurala este determinata de rnodul aranjarii reciprocc a structurilor secundare. De accea, un imperativ primordial pentru prognosticarea stmeturii proteinelor o au principiile de impachetare a elemcntclor constituente. Se 5tie ca un rol deosebit in acest context il joaca repartitia resturilor hidrofobc in a-clice $i (3- stmetura.
-44-
Proteinele se mai clasifica (W. Bennet §i R. Huber, 1984) §i dupii dinamica dome- niilor structurale:
I. Proteine cu domenii rigidc, imobile, dure, unite prin segmente mari, flexibilc, ce le pen-nit acestora fluctuatii in diapazon larg reciproc.
II. Proteine cu domenii rigide, dure, unite prin portiuni mici, denumite “Balama”, cu o circulatie mai redusa.
III. Proteine in care domeniile au roluri diverse - folosesc flexibilitatea pentru asigurarca unor functii (de legare); interactioneaza cu grupari detenninate de antigen.
Clasificarea proteinelor e o problems dificilS, deoarece structura multor proteine nu este sludiata complet. O clasificare a proteinelor dupS functie e practic imposibilS. Exista proteine cu structuri apropiate, dar care indeplinesc functii diferite. Posibilitati limitate de clasificare prezintS ?i proprietatile fizico-chimice.
Dupa atitudinea fata de hidrolizd se disling proteine simple §i proteine conjugate (proteide). Proteinele simple la hidroliza eliminS numai aminoacizi, iar cele conjugate mai contin §i un component neproteic $i, deci, deosebim: fosfoproteide, cromoproteide, nucleoproteide, glico-, lipo-, metaloproteide.
Holoproteinele (proteine simple). Protaminele au o masa moleculara mica §i un caracter alcalin, determinat de prezenta argininei §i lizinei - 60-80%, fiindu-le caracteristic punctul izoelectric ce se aflS in mediul alcalin §i la fierbere se coaguleazS la adaosul bazei in solutie. Proteinele sunt solubile in apS, se dizolvS §i in solutie de NH4, solutii diluate de acizi §i baze. Aceste proteine se gSsesc in cantitati mari in celulele genninale naturale ale pe^tilor: salmina (laptii somnului), scumbrina (scrumbia), clupeina (heringul), in componenta lor triptofanul lipse$te. Aminoacizii ce contin sulf in majoritatea lor nu includ, de alllel ca §i tirozina, §i fenilalanina.
Histonele din componenta nueleului celular iau parte la reglarea metabolica a activitatii genomului. Aminoacizi bazici se contin pinS la 30%. Masa lor molecularS e mai mare decit la protamine, contin putin sau deloc triptofan. Sunt solubile in aceia§i solventi §i precipitate de solutiaNH4, se coaguleaza la incSlzire.
Albuminele .v/ globulinele prezintS masa principals a proteinelor sanguine, a lactate- lor, masei musculare, a proteinelor oului. Raportul albumine-globuline in diferite tesuturi ramine consbmt §i este egal cu 1,5-2,3. In patologie acest coeficient se scliimbS. Albuminele sunt mai solubile in apS, pe cind globulinele sunt solubile numai in solutii diluate de saruri, iar in celelalte Ccizuri — insolubile. Solubilitatea difcritS c folositS pentru fractionarea si detenninarea lor in practica clinicS. Pentru ultimele scopuri azi se folose^te electroforeza pe hirtie sau in gel, la cantitSti neinsemnate de singe. Albuminele contin 575 aminoacizi, fonnind un lant polipeptidic, au mi punct izoelectric mic. Ele detennina presiunea oncoticS a singelui, iau parte la transportul substantelor, prezinta o fractie omogenS. Globulinele formeaza o fractie heterogenS, fiecare comportind diferite functii.
Glutelinele si pmlaminele sunt proteine de naturS vcgctalS, se depozitcazS in semintele cerealelor, masa principals a glutenului.
Prolaminele sunt solubile in solutie apoasa de alcool etilic (60-80%). Contin 20-25% acid glutamic §i 10-15% prolina. Reprezentantii prolaminelor sunt: gliadina (gnu), zeina (pommb), orzeina (orez), hordeina (orz).
-45-
-46-
Figura 1.14. Tipologia tutor structuriproteice: a - spiralele sunt in forma de cilindre yi spirale;
P - structura e reprezentata prin sageti;
a) proteina in a-structura (miohemeritina);
b) proteinu in p- structura (Cu, Zn-superoxiddismutaza);
c) a/pstructura (2 proiectii ale donteniului NAD din LDH);
d) hemaglutenina virusului gripei;
e) a/P structura (triozofosfatizomeraza);
f) CAP din E. coli;
g) a+P structura (lizozim);
h) neuroaminidaza virusului gripei.
-47-
Heteroproteidele (proteine conjugate) contin, pe lingS compu§i proteici, diverse grupe neproteicc numite grupe prostetice. Acestea sunt mai profund studiate. Ele sunt indispensabil legate de proteinS §i prezinta un anumit intercs biologic.
Nucleoproteidele sunt compuse din proteine $i acizi nuclcici. Denumirea lor e derivata de la numirea nucleului celular, dar se aflS ?i in alte compartimente ale celulei. De aceea nucleoproteidele constituie o clasS individuals de substantc organicc, cu o components, structure §i functie independents de localizarea lor in celulS. AstSzi putem afirma cS nature proteinelor studiate in celulS e detenninatS de un reprezentant al nucleoproteinelor - DNA.
ProprictStile organismelor vii, ale celulelor §i intregului organism sunt detenninate insS de proprietStile proteinelor sintetizate. La hidroliza perfects se observS descompuncrca nucleoprotcidelor in proteine $i acizi nucleici. Componenta proteicS o alcSLiiesc histonclc bogate in argininS §i lizinS. Nature proteinelor nu este suficient studiatS.
Cromoproteidele sunt compuse din compartimentul proteic $i cel neproteic colorat, de unde provine §i denumirea lor; iau parte activS §i obligatorie la proccsele de acumulare a energiei, incepind cu fixarea energiei solare in plantele verzi, utilizarea ei judicioasS de cStre organismul animalelor §i al omului: fotosintezS, respiratia celularS, transportul 02 §i CCL, reactiile de oxido-reducere, senzatiile de luminS §i culoare etc.
Reprezentanti: clorofila, hemoproteidele, sistemul de citocromi, catalaza, peroxida- za. La baza structurii grupei prostetice se aflS inclul porfirinic, care aditioneazS elemente chimice diferite (Fe, Mg).
Fosfoproteidele sunt proteine compuse dintr-o parte proteicS $i acid fosforic. Accstor molecule Ic sunt proprii legSturi esterice ale acidului fosforic cu proteina ce se aditioneazS prin OH al aminoacizilor—serina, trconina.
Reprezentantiiproteidelor—cazeinogcnul (proteina laptelui), fosfovitina, vitelina, vitelinina (din gSlbenu§ul oului), ihtulina (icre de pe§te)—ocupS un loc deosebit in compnsii ce contin fosfor, multi dintre ace§tia se gSsesc in sistemul nervos central. Fosfatul labil e absolut necesar pentru fiinctionarea celulei §i exercitarea menirii sale biologice. In procesul de cmbriogenezS, de credere postnatalS §i dez\'oltare servesc drept material pretios energetic !ji plastic. Un §ir intreg de enzime, ce regleazS proccsele de metabolism celular, se caracterizeazSprin legStura strinsScu fosfoml.
Glicoproteidele, ca exponenti ai grupei prostetice servind glicoaminglicanii, se includ in tesuturi §i in foirnS liberS. LegStura cu glucozamina, galactozamina com- pusilor proteici se realizeazS prin asparaginS, serinS, treoninS. Componenta glucidicS determinS rolul biologic al glicoproteidelor indispensabili de existenta membranelor celulare, participind la reactiile imunologice, schimbul de ioni, adeziunea intercelularS.
Lipoproteidele, ca grupS prosteicS, sunt reprezentate de lipide neutre, acizi gra?i liberi, fosfolipide, colesterol, cu flinctii variate. Fiind conipu?i ai membranelor celulare ?i organitelor, pot exista §i in formS libera in plasma singelui.
Metaloproteidele—metalul este legal complex de resturile de aminoacizi (transfen- nS, ceruloplasmins, feritinS). Aici se includ §i unele proteine enzimatice ca anhidraza carbonica (Zn), ascorbatoxidaza (Cu) etc.

PEPTIDELE ACTIVE

Endotelinele reprezinta o familie de peptide noi cu o activitate biologica deosebita. In 1988, M. Yanagisawa §i alti savanti au capatat din cultura endoteliului vascular un peptid cu un elect biologic foartc pronuntat, numft endotelina. Timp dc zece ani s-a cfectuat un studiu amplu referitor la peptida respectiva, receptorii ci, enzima - endotelin convertaza §i inhibitorii ei.
Endotelinele sunt cei mai efectivi factori vasoactivi. Sunt implicate in patogenia unor forme de maladii hipertonice, ischemii renale, hemoragii subarahnoidale. Este determinat rolul lor in infarctul miocardic, aritmiile cardiace.
De rind cu endotelina-1 (ET-1), un peptid biciclic din 21 aminoacizi, s-au depistat §i alte 2 izoforme - ET-2 §i ET-3, codificate probabil de gene diferite. Aceste peptide sunt marea speranta a savantilor pe viitor! Toate trei endoteline in mod diferit sunt expresate in tesuturile vasculare. Primele doua au o activitate majora de vasoconstricton.
Sunt donate $i seevenate 2 tipuri de receptori (ET-A $i ET-B), care s-au depistat atit in endoteliul vaselor, cit §i in rinichi, plamini, suprarenale, tesutul nervos. Constrictia vaselor e mediata de ET-A receptori, structuri fixatoare de G-proteina; pe cind inductia receptorilor ET-B conduce atit la constrictia, cit §i la dilatarea vaselor. Functia acestor receptori e cuplata cu activarea fosfolipazei C $i A,, cu majorarea nivelului de Ca2+ intracelular, fonnarea intensiva a prostaciclinei §i/sau tromboxanului A,. ET-1 §i ET-3 in tesutul nervos intensified sinteza fosfoinozitfosfatului.
ET-1 apare ca rezultat al proteolizci limitate a endotelinei majore - (B = ET) in trei etape:
a) hidroliza protcolitica a preproendotelinei-1 la Arg(92) in endotelina-l-Lys- Arg (40) sub actiunca convcrtazei (E,);
b) hidroliza capatului C-terminal B = ET-1-Lys-Arg(40) la B = ET-l-(38) de o carboxipeptidaza (E,);
c) scindarea premergatorului B-ET-1 la legatura Trp(21) = Val (22) cu formarea endotelinei ET-1, etapa determinata de convertaza respectiva (E3).
Schematic:
Pre-Pro-ET-1 B=ET-1-Lys-Arg(40) B-ET-1 (38)
e3 „ Endotelina-1
E3 (enzima endotelin convertaza - ECE-1) este o metalproteinaza din grupa celor fixate in membrana, care participa in procesingul postsccrctorial al hormonilor peptidici §i neui'opeptidclor. Are unelc proprietati asemanatoare cu familia Zn2’ - metaloproteazelor. In centrul activ este restul Tyr §i regiunea fixatoare de Zn2+.
E depistata enzima ECE (endothelin-converting enzyme) in majoritatea tesuturilor. Activitatea ei e determinata atit prin metode imunochimice, cit §i prin testare biologica. Ea prezinta un dimer cu subunitatile de 120-130 kDa fixate prin punti disulfidice. Splaisingul altemativ a demonstrat variante ale ECE ca grupa N terminals e diferita, cu o specificitatc selectiva la substraturi. ECE-1 arc o specificitate mare la B-ET-1 si mult mai putin efectiva la ET-2 si ET-3. Aceste date presupunprezenta enzimei in mai multc izoforme ale F.CE- 1 (1 oc §i 1(3).
-40-
ECE-2, o alta endotelin convertaza, in 59% e omoloaga cu ECE-1 - o expresie majora e depistata in tesuturile crcicrului. Ambele enzime au structuri de baza comune: sunt proteine intcgrale membranare de tip II, ce contin o secventacu Zn2’ caracteristica; au 10 site-uri glicozil, cu o localizare nu chiar identica, sunt inhibate de aceia§i inhibitori cu diferita sensibilitate.
ECE-2 hidrolizeaza B-ET-1 mai efectiv decit B-ET-2 §i B-ET-3. Dar cea mai esentiala dcosebire e pH optim pentru forma 2, care este egal cu 5,5, §i enzima e neactiva la valori neutre, optime pentru ECE-1. Prezcnta, de asemenea, a ECE-2 in tesuturile neendoteliale demonstreaza ca acest ferment fimctioneaza ca enzima extra- $i intracelulara, responsabila de hidroliza intraveziculara a precursomlui ET-1, sintetizat in aparatul Golgi. Cele prezentate presupun 2 tipuri de sinteza a endotelinelor: extra §i intracelulara.
Sunt depistate §i enzime ce degradeaza fiziologic endotelinele «mature»- metaloendopeptidaza cu pH optim de 5,5; «endotelinaza» (serin proteinaza).
Endotelina ?i, corespunzator, ECE regleaza tonusul vaselor §i, in general, cardiohemodinamica. Peptidul participa la patogenia hipertensiei esentiale - inhibitorii ECE previn dezvoltarea hipertensiei pulmonare in experiment. Efectele sunt dependente de functionarea sistemului renina-angiotenzina.
S-au depistat unele efecte neurologice ale ET-1 §i ET-3, modificari in reactiile de comportare, efect central cardiorespirator.
In prezent se presupune ca endotelinele, de rind cu alti reglatori ca histamina, bradikinina, angiotensina II, participa la relisingul diferentiat al adrenalinei §i/sau noradrenalinei din suprarenale in stres (situatii extremale). Esential e rolul lor in reglarea starii functional a endoteliului - stratului intim arterial §i venos din diferitele vase ale organismului. Dereglarile metabolismului nonnal al endotelinelor, expresia intensiva a precursorilor §i receptorilor respectivi, activitatea majora a ECE devin factori de dezvoltare a proceselor patologice din organism, motiv care impune investigarea unor metode de control §i de reglare a activitatii lor in organism - inhibitor'll metaloproteazelor. Inhibitor clasic sc considera fosfoamidonul. Mult mai activ este analogul tiorfanului. In baza corupuijilor acidului fosfonic s-au sintetizat inhibitori ai ECE, foarte putemici §i sclectivi. Sunt utilizati §i analogi ai ET-1, care blocheaza activitatea ECE atit in vitro, cit $i in vivo.
In ultimii ani se confirma ca unele peptide cu o structura foarte simpld, predominant din glicina §iprolina (PG, GP, PGP, GPGG), poseda o activitate biologicd deosebitd referitor la coagularea singelui, actiunea protectoare a mucoasei, nociceplie. La aceste peptide se alatura $i PGc (ciclic) depistat in creier. O particularitate deosebita a acestor fragmente, ce contin prolina tenninala, este stabilitatea majora in lluidele organismului fa(a de altele (de mii de ori).
Aceste peptide au ca sursa $i alimentclc, caci e stabilit ca tripeptidele ce contin prolina sunt absorbite de celulele endoteliale intestinale nescindate. Un precursor al lor poate fi $i enterostatina (APGPR), precum si colagcnul si elastina.
Compartimentalizarea stricta a proceselor permite rcalizarea unor fiinctii diametral opuse, de exemplu, acidul glutamic, glicina, care indeplinesc atit rol plastic, cit §i energetic ?i servesc drept neurotransmitatori. Asemenea compartimentalizare e reala si pentru
-41 -
precursorii peptidelor reglatoare (PR). Determinant poate fi tesutul, organul, precum §i repartitia locala a proteazelor.
S-a stabilit ca aceste peptide blocheaza agrcgatia trombocitelor, formarea trombinei $i a fibrinei; sunt inhibitori ai fibrinazei (XIIIa). Posibil ca aceste peptide simple ce contin prolina (fragmcnte ale colagenului $i clastinei) sunt factori endogeni cu actiune de antitromboza $i trombolitica.
Prolincomponentele peptidice, PGP §i GPGG, amplified rezistenta mucoasei gastrice la actiunea factorilor nocivi, devenindprotectori antiulcerop. Este inhibata endo- §i exosecretia pancreasului, motorica stomacului, utilizarea alimentelor (anorexia) de enterostatina (pentapeptida APGPR).
Peptida GPc are efect stimulator in consolidarea memoriei, posibil se formeaza din colagen sau elastina.
Peplidele scurte, ce contin prolina, sunt activatori ai hemolaxisei, favorizeaza formarea superoxidului, neutralizeaza analgezia provocata de morfina. Comparind structure peptidelor respective, se presupune dependenta efcctului de prezenta prolinei la capatul N-sau C-tenninal al peptidei.
Carnozina - dipeptida (3-alanil-L-histidina, extrasa in anul 1900 din mu§chiul scheletal. In prezenta acestei dipeptide, mu§chiul izolat de broasca se contracts ca §i la acumularea cantitatilor mari de lactat; pi a camozinei este de 6,9, iar a anserinei - 7,1 - ultima este derivatul ei metilat. Acc§ti compu^i sunt ideal adaptati pentru rolul de tampon in regiunea fiziologica a pH - au o cota pina la 40%.
NH
-CH->— CH—NH—C—CH2 — CH,— NH,
I
COOH
O
Carnozina
Capacitatea tampon protonica marimea (I- se masoara in “slake” §i se determina dupa numarul de mkmol NaOI I sau I IC1, necesari pentru a modifica pH a 1 g tesut cu o unitate - de la 6 la 7 sau 6,5 - 7,5. Se considera ca §i peptidele inrudite iau parte la reglarea activitatii enzimatice, la diminuarca reactiilor oxidante.
Datelc experimentale confinna ca carnozina prczinta un antioxidant multifunctional, capabil sa inactiveze radicalii liberi, sa formeze compu§i chelati cu metalele prooxidante (Cu) §i poseda capacitatea de a forma conjugate cu produse aldehidice toxice de oxidarc a lipidelor. in prezenta camozinei, limita Heiflik se cxtindc - celula din cultura imbatrinc§tc mult mai lent. Posibil, e §i rczultalul unic al efectului diferit al camozinei ca: izvor al histidinei, imunostimulator §i neurotransmiter etc.
Glicozilarea nefennentativa a proteinelor este un proces dependent de virsta, activ in diabet. Formarea lcgaturilor transversale intre polipcptidele modificate §i proteinele normale este cauza complicatiilor in diabet. S-a confirmat ca carnozina este un agent antiglical natural, ce se contine preponderant in mu§chii albi cu o glicoliza intensiva. Carnozina indusa de aldchida malonica inhiba formarea in proteine a legaturilor transversale, precum $i fonnarca gmparilor carbonilice in proteine, specifice la imbatiinirea proteinelor $i celulelor. Carnozina e capabila sa rcactioneze cu metil-glioxalul §i, indusa
-42-
dc cl, preintimpina modificarile proteice. Camozina protejeaza celulele de actiunea toxica a aldehidelor §i cetonelor.
Proteinele glicate sunt imunogcne, iau parte la generare in procesul de imbatrinirc a autoantigenelor. E stabilit ca camozina glicata nu e mutagena, spre deosebire de aminoacizi. Ea inhiba reactia de glicare a lizinei, moduleaza toxicitatea produsului pentru cultura celulelor.
Imbatrinirea proteinelor este insotita de acumularea polipeptidelor aderante, indeosebi ale celorcecontingrupa carbonil. Ultimeleapar ca rezultataloxidarii radicalilor aminoacidici de FAO, precum §i la interactiunea produselor oxidarii lipidelor- aldehida malonica §i hidroxinonenalii - cu lizina §i in al treilea rind, in procesul de glicare in care aldehidele toxice indue fonnarea gruparilor carbonil in proteine.
S-a constatat ca camozina nu doar se fixeaza de gruparca carbonil din proteine, dar §i moduleaza activitatea lor, inhibind fonnarea legaturilor transversale in proteine, ca rezultat al generarii complexului proteina-carbonil-camozin aduct.
Deocamdata nu e clar unde anume are loc fonnarea acestui complex: in interioml celulei sau in afara ei?
Care estc soarta proteinelor camozilate?
Posibil ca reprezinta o forma a lipofuscinei - pigmentul imbatrinirii. Lipofuscina are o natura foarte heterogena ?i efectele ei sunt controversate. E enorm de multa in tesuturile bogate in camozina- nervos §i tnuschi, creier. Posibil ca forma lipofuscinei fara camozina e capabila sa reactioneze cu alte macromoleculc cclulare.
O alta varianta ar fi proteoliza - scindarea de un sistem deproteozome. Camozina mascheaza gruparilc carbonil, care sunt rezistente $i chiar pot inhiba fimetia proteozomelor. S-a constatat ca in prezenta camozinei se activeaza metabolizarea unor proteine greu metabolizante.
Gmpele carbonil se fonneaza $i la oxidarea fosfolipidelor (etanolamina) membranare. La depurinizarc §i depirimidinizare a DNA, cu scindarea legaturilor glicozidice, se fonneaza o molecula de D-oxiriboza cu proprietati toxice aldehidice. Camozina fixeaza, posibil, $i aceste fonne toxice, inhibind formarea legaturilor transversale proteina - DNA, cu participarea aldehidelor, §i mic§oreaza numaml de aderatii cromozomiale in cultura celulara. Camozina favorizeaza procesele de detoxifiere. O data cu imbatrinirea, concentratia camozinei se mic§oreaza: nivelul coreleaza cu durata vietii. Indivizii care au o statura inalta sunt asigurati cu longevitate mai mare.
Biosinteza camozinei: se sintetizeaza din fi-alanina ^i histidina, reachC QataJizata de carnozin sintaza. P-alanina — aminoacid neproteinogen se produce in ficat ca metabolit final in degradarea uracilului ?i a timinei. Celulele capabile de sinteza poseda $i un sistem benefic de transport al acestui aminoacid. Cu cit celulele sunt mai diferentiate, absorbtia (3-ala este mai efectiva. In oligodendrocite viteza maxima de sinteza corespundc capacitatii majore de expresie a protcinei - mielina - marker al diferenticrii oligodendrocitelor in creier.
Camozina e legata de celulele neurogliei, care pot absorbi rapid camozina marcata pi int-un mecanism activ de transport al dipeptizilor. E prezenta camozina in neuronii senzitivi, impreuna cu acidul glutamic, ce marcheaza rolul de neuromediator in acest
-43-
proces. In secretie se considera ca sunt prezente mai multe mecanisme (depolarizare membranara, tumefierea astrocitelor cauzate de ionii K*, invcrsarea mecanismclor de transport). Se confirma mecanismul vezicular, exocitoza determinata de Ca2+.
Camozina este un inliibitor selectiv al NO-dependent-activare a guanilatciclazei, ce o poate utiliza ca remediu efectiv la tratarea sepsisului, cancerului, astmului, migrenei, toate fiind legate de activarea sistemului de semnalizare intracelular: NO-Gc solubila- GMPc.
Hidroliza camozinei e cauzata de 2 izoenzime: 1) camozinaza tisulara (citozolica) ?i
2) cea serica(KF.3.4.13.3 §i KF3.4.13.20). Fonna tisulara e zincodependenta §i poate fi stabilizata de alte metale bivalente (Cd >Mn »Zn »Co).
Camozina mare$te de 2-3 ori longcvitatea celulelor cultivate in vitro. E stabilit efectul de intinerire a celulelor senile. Camozina distruge celulele transformate sau cancerigcnc. In amestec cu pimvatul (acidul oxaloacetatul §i a-cetoglutaratul), efectul se mic§oreaza. Citralul, izocitratul, fumaratul, succinatul $i malatul nu influenteaza asupra efectului citotoxic al camozinei.
Efectul camozinei poate consta in:
a) diminuarea gradului sau exprimarca efectelor care conduc la includcrea mecanismelor ce blocheaza ciclul cclular. De exemplu: poate favoriza mic$orarea lungimii fragmentelor pierdute in DNA-telomerica sau diminueaza metilarea DNA;
b) micsorarea efectelor fiziologice determinate de modificarile in RNA, ce ar favoriza indepartarea momentului de oprire terminals a diviziunii celulelor. Un astfel de efect s-ar manifesta in intinerirea fenotipului celular, care se obscrva la cultivarea celulelor in vitro cu camozina. Camozina, posibil, inhiba glicoliza, de altfel $i fonnarea de ATP in celulele cancerigene. Acest efect e reversibil la adaosul piruvatului.

FOLDINGUL. PROBLEMA IMPACHETARII SPECIFICE A LANTULUI POLIPEPTIDIC

Au trecut mai mult de 40 de ani de la descoperirca §tiintifica a lui C. Antinsen, dar $i acum sute de savanti studiaza problema impachetarii specifice a lantului polipeptidic.
S-a dovedit ca a prezice conformatia proteinei in baza succesiunii de aininoacizi (tinind cont de proprietatile lor, de solubilitatea in apa) nu e atit de simplu. Problema are §i aspect practic: paralel cu dezvoltarea biotehnologiei $i in baza reconstruirii genelor se poate asigura sinteza noilor proteine.
S-a stabilit ca la impachetarea unor proteine imense iau parte §i proteinele mult mai mici, numite ciaperonine, ce se intilnesc in bacterii, citoplasma celulelor eucariote, matrixul mitocondrial. Sunt compuse din 2 elemente ce aparfin diferitelor familii proteice - lisp 60 (Gro EL) §i Hsp 10 (Gro ES), mai substantial sunt studiate ciaperoninele la E.coli.
Gro EL e constituit din 14 subunitati idcnticc, protomeri cu masa moleculara 57 kDa (548 resturi de aminoacizi), ftecare aranjati simetric cite 7. Analiza rocntgcnostructurala a descifrat structura spatiala a complexului. Fiecare protomer e compus din 3 domenii - eucatorial, apical §i intennediar.
-35-
Gro ES (co-ciaperoninele) sunt compuse din 7 protomeri identici aranjati simetric, masa moleculara a protomemlui e de 10 kDa §i confine 97 resturi aminoacide. Structura spatiala a protomerului prezinta un nucleu de (3-structura plianta inconjurata de inici structuri de a-elice (fig. 1.13).
Fiecare protomer in ciaperonine poate fixa cite o molecula de ATP. Au fost determinate locusurile functional, unde are loc fixarea ATP, a polipeptidului substrat §i a Gro ES in Gro EL. Sunt constatate particularitatile ciclurilor reactibile in ciaperonine la fonnarea complexului activ functional §i fixarea substratului polipeptidic. Suntpropuse diferite modele ale complexului, posibilele mecanisme de functionare §i asamblare a protcinelor prin ciaperonine.
Complexul ciaperoninelor poseda activitatea ATP-azica, se presupune ca complcxul functional activ e obligat sa asigure conditiile cinetice primare pentru asamblarea proteinei in afara ribozomului, in portiuni mai indepartate in citozolul celulei, S-a constatat ca fonnarea complexului activ necesita ionii de K+. Sunt date experimentale ce confirma ca in vivo asamblarea lantului polipeptidic inproteina activa are loc cotranslational, adica in acela$i timp cu sinteza lantului in ribozom.
Cum are loc procesul de autoimpachetare a proteinelor?
Lanturile polipeptidice desfa§urate sau proaspat sintetizate sunt numite ghemuri dezordonate. Studiul asupra proteinei denaturate a stabilitca in interiorul ei apar regiuni rasucite, asociate intr-un mod anume §i diferite de intreaga molecula. Accste substructuri (subdomenii) sau numai unele dintre elc sunt nestabile, fluctuante, scrvind in calitate de detonant (fitil), in jurul carora se fonneaza regiuni stabile structurale.
Despre starea denaturata a proteinei se §tie mult mai mult decit despre cea desfa- §urata. Una din primele legitati ale impachetarii consta in faptul ca contactui dintre moleculele de H,0 §i aminoacizii hidrofobi trebuie, pe cit e posibil, sa fie minim. A doua legitate: globula proteica urineaza sa fie impachetata compact, insa spatiul ci trebuie sa fie umplut astfel incit atomii invecinati sa nu se intercaleze.
La momentul actual se disting doua conceptii:
Prima, mai putin pronuntata, este cea care presupune ca lantul polipeptidic colapseaza rapid pina la dimensiunile finale ale globulei, cu ie^irea aminoacizilor hidrofobi din contactui cu apa. in starea data molecula se reorganizeaza rapid, capatind proprictatile ei de structura secundara §i tertiara (datele experimentale confirma aceasta teorie).
A doua conceptie, mai reu§ita, stabile§te ca lantul polipeptidic desfa$urat foarte rapid formeaza segmente constante, limitate de structura secundara. Ele interactio- ncaza $i temporar se realimenteaza reciproc. Segmentele stabilizate, microdomeniile respective transforma conformatia moleculei proteice in directia organizarii supreme prin asociere cu alte segmente, favorizind contactele dintre segmentele indepartate. In stadiilc tranzitorii se fonneaza intermediate, structuri ce pot fi determinate foarte greu, dat fiind existenta lor de scurta durata.
Caracteristica structurilor vizate:
a) au dimensiuni mai mari decit molecula nativa §i poseda elemente fonnate de structura secundara;
-36-
protcinei
(b)
Figura 1.13. Ciaperoninele in foldingul proteinelor:
(a) mecanismul de actiune a ciaperoninelor E.coli GroEl (apartinc familiei proteinelor IIsp60) $i GroES. Fiecare complex GroEL poseda 2 site-uri formate din 2 inele heptamerice (masa moleculara egala cu 57 000 Da). GroES este, de asemenca, heptamcr (masa moleculara egala cu 10 000 Da) §i poatc bloca unul din site-urilc GroEL.
(b) suprafata §i scctiunea complexului GroEL/GroES. In imaginea sectiunii sc vede spatiul intern al complexului, in interiorul caruia se aniplascaza alte proteine.
- 3 7 -
b) savantii au desfa§urat proteina nativa si apoi au realizat impachetarea, oprind-o la diferite etape; au identifical intermediatelc dupa formarea legaturii S-S, ce apareau in procesul de impachetare $i apoi dispareau pe neobscrv'atc in molecula nativa.
S-a demonstrat ca unele fragmente formeaza asociatn temporare, altele stabile, §i se pastreaza in globula nativa, avind un rol fundamental la initierea procesului dc impachetare a lantului. Intermediatele au fost studiate prin metoda izotopilor. Hidrogenul din grupele pcptidice a fost inlocuit cu deiteriu prin incubatia lantului polipeptidic in apa grea. Apa grea substituita apoi cu cea obi§nuita favoriza includerea hidrogenului in legaturile neformate, §i in continuare, procesul avansa pina la finisarea deplina. Identificarea regiunilor cu deuteriu a developat fragmentele moleculelor ce se impachetau in primul rind. A§a s-a stabilit consecutivitatea formarii intermediatelor. S-a confirmat ca in citocromul C are loc asocierea primara a doua spirale in capetele opuse ale lantului polipeptidic. in ribonucleaza, la inceput, se formeaza (3-structura situata in centrul moleculei.
impachetarea poate fi determinata $i prin metode matematice, cu utilizarea functiei energiei potentiate. In computer se introduc valorile in ciffe care caracterizeaza fortele de atractie intre perechile de atomi ai moleculei din lanturile polipeptidice. Apoi se iau coordonatele atomilor la care energia totala a moleculei se mic§oreaza pina la minim (in eventualitatea ca structurile finale au energie minima). Studiile recente elucideaza posibilitatea precizarii structurii tertiare dupa succesiunea aminoacizilor. O serie de investigatii confirma faptul ca pentru impachetare sunt necesari factori spatiali §i interactiune hidrofoba. Rolul diferitelor forte variaza de la o proteina la alta. E posibil ca fortele electrostatice joaca un anumit rol la stabilizarea conformatiei finale, dar nu §i la fomiarea ei.
Rezultanta finala a foldingului este confonnerul nativ ce poseda activitate biologica. Un doineniu cu o structura stabila secundara care se formeaza primar, comparativ cu cealalta parte a moleculei, e numit foldon.
Asamblarea proteinelor se considera un proces fizic de o valoare biologica deosebita. Modelarca computerizata a procesului confirma ca asamblarea demareaza de la lantul desfasurat care fluctueaza mult timp fara formarea unor contacte native esentiale. Apoi lantul atinge intimplator starea in care persista un ansamblu de contacte native. Dupa aceasta situatie, procesul de asamblare decurge foarte rapid pina la starea finala - fonnarca structurii native.
Se considera ca un pas-limita in asamblarea acestor catcnc cste formarea primara a unui complex de contacte native (nivelul asamblarii), care, fulgerator, influenteaza toata molecula. Acest nucleu nu e identic cu starile intermediare. S-a consolidat ideea ca:
a) asamblarea incepe cu formarea unui complex detenninat de contacte native;
b) resturile ce se ihclud in acest nucleu sunt aranjate la diferite distante in lant.
Studiile au stabilit ca nucleul asamblarii este constituit din rcsturi nefunctionale
mai conservative - proteinele legate evolutiv poseda 2 complexe de resturi conservative: unui pentru centrul functional §i altul pentm nucleul de asamblare.
Asamblarea eonfonn conotatici «totul sau nimic» corespunde mecanismului nucleatiei $i cre§terii §i c tipica pentru proteinele foarte mici. Asamblarea proteinelor majore trecc
-38-
prill stari intennediare. Una dintre ele este §i globula in fuziune ce sc caracterizeaza prin stare intermediara compacts cu structurS nativS asemSnStoare, dar farS structurS tertiara rigidS, prin lipsa de cooperativitate la temperatura de topire §i mi§cSrile intramoleculare rapide. O stare asemanatoare e proprie §i intcrmediatelor.
S-a demonstrat cS in globula in fuziune, molecula proteicS pSstreazS unelc particularitSti ale topologiei native (aranjarea reciprocS a a §i (3 structuri), aranjarea rigida a catenelor proteice. Aceasta clasifica globula ca intermediat intre catena desfa§urata §i starea nativa, stare termodinamicS intre cele douS. Se presupune ca molecula proteica poate exista in trei stari: nativa, globula in fuziune $i cea desfa$urat5.
S-a stabilit ca globulele in fuziune, genetic, sunt un intermediat universal pentru asamblarea protcinelor.
A$adar, prin folding se subintelege aranjarea spatiala corecta de novo a catenei proteice, iar refoldingulpresupune aranjarea spatiala dupd denaturare.
Studiile contemporane confirms ca proteinele auxiliare pot fi impSrtite in 2 grupe: ciaperonine moleculare §i enzime. Prima grupa constituie o clasa functionala de proteine neomogene, care favorizeaza asamblarea corecta necovalenta a altor structuri polipeptidice in vivo, nefiind componente ale acestor structuri organizate, ce ii indcplinesc functiile biologice. Sunt evaluate multe proteine cu functii asemanatoare - proteinele §ocului termic formeaza o grupa mare de ciaperonine.
Enzimele denumite foldaze catalizeaza modificarile covalente, strict necesare la formarea confonnatiilor native functionale ale diferitelor proteine. Deocamdata sunt idcntificate 2 enzime ca foldaze -proteindisulfidizomeraza (PDI) ce catalizeaza formarea legaturilor native disulfidice §ipeptidil-prolil-cis-trans-izomeraza (PPI) ce catalizeaza izomerizarea unor legaturi stabile trans-peptidil-prolil in cis-confonnatie, necesare pentru asamblarea functionala a proteinelor. Ambclc sunt rcactii covalcntc, rcactii-limite in etapele foldingului proteinci corcspunzatoarc. Procesul de Folding §i formarea disulfidelor native sunt procese strins legate intre ele §i decurg simultan.
S-a constatat ca PDI prezinta nu numai o izomeraza ce catalizeaza formarea legaturii disulfidice in peptidele sintetizate, dar §i o ciaperonina moleculara, ce participa la procesul foldingului catenelor. Activitatea ciaperoninica nu e dependents de cea izomerazica. Functionind ca foldaza in procesul de folding, este necesara atit activitatea izomerazica, cit $i cea ciaperoninica.

STRUCTURA TRIDIMENSIONALA

Aceasta structura rezulta din inter- actiunea stricta a resturilor dc aminoa- cizi care in succesiunea liniara se loca- lizeaza dcpartc unul de altul, acesta fiind modul de impachctare a lantului poli- peptidic intr-un volum anumit.
Forta motrice la aparitia acestei structuri e interactiunea radicalilor ami- noacizilor cu moleculele de apa. Cu alte cuvinte, structura e determinata dc marimea, fonna, polantatea acestor ra- dicali. Anume structura tridimensionala contine informatia functionala, ce sta- bile§tc proprietatile biologice §i infonnatia nativa a protcinelor.
Un lant polipcptidic adopta, in masura in care-i permite structura sa primara, configuratii de a-elice, de p-structura; impachetarea lantului cauta sa satisfaca §i afmitatile radicalilor, ccca ce fixeaza conformatia ei. Aceasta con- formatie e un compromis, deoarece nu se pot realiza toate legaturile posibile, dar acest compromis este cel mai favorabil §i cel mai stabil din punct de vedere energetic.
Stabilizarea structurii e determinata de acelea^i legaturi: de hidrogen, electrostatice, hidrofobc, Van der Waals. Prima protcina, a carei structura a fost stabilita, este mioglobina - proteina ce leaga 02 in mu§chi. Ea contine in catena polipeptidica 150 aminoacizi §i o grupare neproteica numita hem (fig. 1.7).
Figura 1.6. Spirula de colagen A - spirala Iripld, sunt prezentati atomii C(X;
B - conformatia unei catene din triplu, este ilustrata secventa - Gly - Pro - Pro;
C - sectiunea transversala prin modelul de colagen - trei catene unite prin leg. H, unde Ca e al Gly.
Figura 1.7.Conformatia catenei mioglobinei (A) j; a catenei fi din hemoglobind (B)
B
-31 -
Scheletul are 8 segmente elicoidale, cel mai lung contine 23 aminoacizi, cel mai scurt -7 aminoacizi, ce includ aproape 80% din resturile de aminoacizi. Radicalii ocupa aproape tot spatiul dintre segmente. Molecula e atit de compacts, incit in interiorul ei pot sa se acumuleze numai 4 molecule de apa.
Regiunile elicoidale sunt separate de segmente neelicoidale la nivelul carora lantul polipeptidic i§i schimba directia. In aceste puncte finale se posteaza prolina. Interiorul moleculei e fonnat din aminoacizi cu radicalul nepolar, exceptie fund doua resturi de histidina ce leaga hemul.
Grupele polare se afla pe exteriorul moleculei, in alte rasuciri - resturi de serina, treonina, asparagina: hemul ce contine Fe leaga o molecula de 0,.
Cum sunt impachetate alte proteine globulare, la fel constituite dintr-un lant polipeptidic?
Citocrom C - proteina ce contine hem, dar se deosebe§te dupa structura secunda- ra, tertiara, succesiunea de aminoacizi ?i proprietatile biologice; lizozima - 40% formeaza structuri elicoidale; ribonucleaza, la fel proteina globulara, contine foarte putine a- segmente, majoritatea se gasesc in (3-structuri, dar ca §i lizozima contine 4 resturi de
cisteina ce determina duritatea structurii (fig.
1.8, 1.9).
In proteinele ce fianctioneaza in cxterioml celulei astfel de legaturi intracatenare disul- fidice sunt pennanente. Fiecarc proteina se caracterizeaza prin structura tridimensionala proprie doar ei, special adaptata pentru indeplinirca anumitei functii biologice. Proteinele acestei clase sunt mult mai complexe dupa conformatie decit cele fibrilare, indeplinesc functii variate §i activitatea lor are un caracter dinamic. in majoritatea lor proteinele sunt globulare.
Care sunt datele experimentale ce confirma ca anume conformatia moleculei e necesara pentru activitatea biologica
Figura 1.8. Scheletul moleculei de citocrom C - in a protein ei?
centru hcmogrupa fixata covalent, mai intensiv ' _
coiorat sunt aminoacizii invariant 1 • b-a constatat ca sub actiunea ureei, la
incalzire, stmctura scheletului covalent
ramine neschimbata, dar lantul polipeptidic
define o conformatie neregulata ?i i§i pierde activitatea biologica.
2. La compararea lungumii lantului §i diametrului spiralei cu marimile reale ale proteinei se constata ca un lant polipeptidic din 584 aminoacizi are in (3-structura o lungime dc 200 nm $i grosime de 0,5 nm, in a-spirala - 90 nm lungime §i grosimea de 1,1 nm, globula acestui lan| se cuprinde in lungimea de 13 nm §i diametrul de 3 nm. A$adar, lantul polipeptidic al albuminei este foarte bine impachetat, in caz contrar nu ar indeplini functia necesara.
-32-
Modul de impachetare a catenelorpoli- peptidice in proteinele globulare intr-oglo- bula sterica e structura tertiara. La forma- rea acestei structuri se evidentiazS centrele active, locusurilc dc fixare ?i identificare a li- ganzilor ce detenninS functia proteinelor.
Concluzie: Daca structura secundarci e determinatei de interactiunea resturilor de aminoacizi in segmentele apropiate, apoi cea tertiara - de interactiunea lor din segmentele depdrtate. Un rol deosebit il are $i interactiunea R-grupelor catenelor invecinate.
O anumitS importantS structuralS in lanturile
Ace§tia se grupeazS la unghi, in locul fixSrii grupelor prostetice.
La o rScire lentS a solutiei proteice sau la evoluarea pi I spre normal, proteina i§i restabile§te functia biologies (renaturatie), fapt ce confirms cS informatia necesarS pcnlru impachetare e determinata de structura primara. Proteina se impacheteaza nu chiar simplu, de exemplu: ribonucleaza in care se formeaza 4 punti disulfidice in acelea§i pozitii ca §i in cea nativa, teoretic, din 8 resturi de aminoacizi se pot forma 105 variante, dar se formeaza numai una. Structura tertiara nu-i rigida absolut, se caractcrizeaza printr-un grad de fluctuate locala §i o anumita elasticitate. De exemplu, moleculele enzimei la legarea substratului i?i schimba confonnatia.
Proteinele se fonneaza din aminoacizi, cu o viteza mare. Proteina compusa din 100 aminoacizi in 5 sec. i§i capata confonnatia finala. Dar daca s-ar cauta toate variantele, ar fi nevoie de 105 ani. Procesul de asamblare are loc momentan, cu un grad mare de cooperativitate. Aceasta inseamna ca daca s-a impachetat un segment mic, apoi instantaneu create probabilitatea aranjarii celorlalte segmente.
Dupa uncle scheme structurale la nivelul organizarii tertiare a moleculelor proteice, in planul de asamblare e inclus un concept nou, care facilitcaza perceperea perfects a raporturilor dintre structura §i functie, a organizarii pe domeniistructurale. Prin cuvintul domeniu se subinteleg regiunile compacte cu organizarea tertiara relativ rigida, separate intre ele de catre segmentele mai putin organizate, care pennit mi§carea unui domeniu fata de altul (fig. 1.10).
Fiecare domeniu stmctural e responsabil de o anumita functie a proteinei. Gradul de flexibilitate a domeniilor variaza de la mi§cari mai ample la altele mai restrinse, in dependents de natura segmentelor interdomcniale. Domeniile se asociazS cu functiile de legaturS. Centrele active ale enzimelor sunt situate intre domenii care i^i schimbS pozitia unul fatS de altul in procesul functionSrii biologice a proteinei. O altS propnetate foarte importantS: domeniile cu stmeturi si proprietSti similare suntprezente in diferite protcine,
compacts
specia organismului respectiv (sursa proteinei).
-33-
Figura 1.10. Imagined schematics a unci proteine compuse din 2 domenii. Centrul de fixare a iigandului se ajla intre domenii
exercitind roluri asemanatoare.
Multe proteine sunt alcatuite din mai muite lanturi polipeptidice $i se numesc proteine oligomere (hemoglobina e constitute din patru lanturi $i patm grupe prostetice cu atomii sai deFe) (fig.
1.11).
Fiecare lant (2a ?i 23) are structura sa tertiara, ocupa pozitia de tetraedru unul fata de altul, formind in ansamblu structura cuaternara. Catena a con- tacteaza cu 3, interactiunea dintre ele (a- a §i 3-3) fund minima. Hemoglobina animalelor are aproape aceea§i structura tertiara §i cuaternara, avind mult in comun cu structura mioglobinei, acelea§i functii. Cu certitudine, in cadrul
succesiunii aminoacizilor, proteinele omoloage contin un rind de resturi de aminoacizi invarianti, 9 aminoacizi ocupa aceea§i pozitie; e aceea§i histidina distala §i proximala, e la fel dc reprezentativ §i interioml nepolar al struclurii.
Modul de asociere in spatiu a protomerilor - moleculelor oligomere - se atestd ca structura cuaternara. La o asemenea proteind funcfia specified se manifesto numai la nivelul structurii cuaternare, protomerii separati sunt neactivi. Asamblarea subunitatilor se realizeaza prin forte slabe nccovalente §i asocierea devine stabila daca suprafetele de contact (ale domcniilor) sunt complementare, iar un numar cit mai mare de atomi se apropie de nivelul razelor Van der Waals. Complementaritatea asigura un grad inalt de exactitate §i de specificitate a structurii cuaternare.
Interactiunea prin suprafetele de contact reprezinta fenomenul de coopera- re, adicaprimele interactiuni favorizeaza formarea cclorlalte. Structurile cuaternare permit functionarea unor mecanisme fine de reglare a activitatii proteinelor (forma T - tensionata §i R - relaxata). Perturbatia are loc la nivelul unui protomer (Fe iese la 0,6 A din planul hcmului, la oxidare intra un plan - histidina proximala avind 15 contacte, modifica conformatia oligomerului, re- stmetureaza spirala §i unghiurile ei) (fig.
1.12).
Figura 1.11. Modehtl hemoglobinei
P-catene sunt colorate mai intensiv; a-catene sunt
celelalte; h - Itemul in molecuta (dupa M. Pcrutz)
-34-
Figura 1.12. Modijicarile conformafionale induse de deplasarea Fe la oxigenare. Structura oxigenata e colorata mat intensiv decit cea dezoxigenata
Majoritatea proteinelor oligomere studiate, de regula, au un numar pereche de pro- tomeri, situati bilateral simetric. Moleculele proteice nu sunt rigide, au o anumita flexibi- litate §i manifestari diferite: de la mi§cari simple in jurul legaturilor ordinare pina la fluctua- tii respiratorii. La fonnarea compu§ilor flexibilitatea scade. Vibratiile moleculare joaca un rol deosebit in procesul de depistare §i stabilizare a starii tranzitorii.