SPECIFICITATEA ENZIMELOR

Cea mai importanta prioritate a enzimelor e inalta lor spccificitate dc actiune - atribut fundamental cc detennina succesiunea reactiilor care favonzeaza calea metabolica.
Multitudinea formelor de manifestare a spccificitatii poatc fi incadrata in 2 catcgorii - cea de reactic ?i de substrat.
1. Specificitatea de reactie estc proprietatca de a cataliza un anumit tip dc reactic ce sta la baza clasificarii enzimelor. Enzimele proteolitice catalizeaza hidroliza legaturilor peptidice:
O O
H2N—CH— C-i-NH— CH—C-i-NH—CH—COOH + 2H20 —►
“ I ' I ' I
R | R2 R2
H2N—CH—COOH + H2N—CH—COOH + H,N— CH— COOH
- 1 • 1 • 1
R i R2 R2
Multe enzime catalizeaza §i hidrolizeaza legaturile esterice, reactia fiind asemanatoare.
R,—C—0-R2 + H,0
II
O
R —C—O + R2-OH
on
Unele enzime au 2 zone distincte in structure lor proteica, fiecare responsabila pentru un anumit tip de reactie specifica.
2. O enzima cu 0 anumita particularitate de reactie poate asigura transformarea corespunzatoare a unui grup dc substantc inrudite chimic — specificitate relativa, sau reactia se resfringe asupra unui substrat—specificitate absoluta. Dreptexemplu de specificitate absoluta pot servi anhidraza carbonica, ureaza, ultima reprezentind o enzima ce catalizeaza unnatoarea reactie:
H2N—C—NH2 + H70 — CO, + 2NH3
H
O
Specificitatea relativa se manifesto in diferite ipostaze:
a) poseda o arie larga, fata dc numarul substraturilor (protcazele in functie de rcsturi de aminoacizi: chimotripsina — legatura peptidica, formata de COOH a Phe, Tyr, Tip; tripsina - de COOH ai Lys §i Arg; trombina —dcCOOH ai Arg $i NH^ai Gly);
b) fonrieaza 0 arie mai ingusta: alcool dehidrogenaza — dehidrogenaza un grup de alcooli monohidroxilici cu un numar mic de atomi de C (specificitatea de grup), adica se manifests prin gi-uparea chimica:
ADH
R-CH2-OH^^ r ch=o
NAD+NADH+ H +
-61 -
c) in lipazele digestive specificitatea coreleaza cu pozitia legaturii esterice intre glicerina §i acizii gra§i:
0
II
CH2-0—C-R,
Lipaza pancreatica
ch2-oh
1
ch-o-co-r2
CH—0—CO—R
ch2—o—c— r3
II
0
2H2° r,-COOH
ch2-oh
R3-COOH
n
E
to
1
0
33
Lipaza in test in a la
tt n >
2 R,- COOH
CH—OH
ch2-oh
Stereospecificitatea de substrat §i de reactie
Majoritatea biomoleculelor poseda un atom de C asimetric §i, bind chirali, pot exista sub forma celor 2 enantiomeri. O enzima ataca numai un izomer—stereospecijicitate:
a) in toate reactiile glicolitice enzima corespunzatoarc actioncaza asupra esterilor fosforici ai D-hexozelor ?i D-triozelor; se utilizeaza numai L-aminoacizii; in aceste cazuri substratul optic activ se transforma in produs care poate fi sau nu optic;
b) cind substratul este inactiv optic, dar este produsul optic al reactici, sc considera ca reactia este o “sinteza asimctrica’ Aceea§i situatie sc observa §i in activitatea tumarazei, SDH, LDH:
H3C— CH-COOH
I
OH
LDH
NAD" NADH+ H
h3c-
COOH
L-acid lactic
Acid piruvic
c) enzimele catalizeaza transformarile doara unui singur izomer -cis sau trans;
d) pentru a utiliza ambii antipozi optici, organismul dispune de racemaze (epimera- ze), care transforma un izomer in altul:
D-alanina —L-alanina
Utilizindu-se substraturi marcate cu izotopi radioactivi, s-a constatat ca unele enzime sunt capabile sa diferentieze doua grupc chimicc identice.
Glicerol kinaza fosforileaza asimetric glicerolul, estcrificind aceea§i grupa de alcool primar:
'ch2— oh
2CH - OH 3 CH2 OH
E
ATP ADP
1 CH?—OH 2CH—OH
3ch2—o—P03
- 62-
Enzimelor le sunt proprii manifestSri absolut spccifice, anumite substraturi. Ele accelereazS diverse reactii chimice, fara formarea produsclorauxi Hare. Moleculelc substratului trebuie sS posede anumite particularitati stmeturale de baza:
a) substratul confine o legSturS chimicS specifics pe care enzima o scindeazS;
b) substratul trebuie sa posede o anumita grupS functionals, grupa de legatura, care jonctioneazS cu enzima ?i oricnteazS moleculele substratului in ccntrul activ. Cu alte cuvinte, legatura chimica a substratului trebuie sa ocupe o pozitie adeevata fata de grupa cataliticS a enzimei.
Ce mecanism de accelerare a vitezei reactiei chimice poseda enzimele?
Pentru a pStrunde acest mecanism, e necesara con§tientizarea unor notiuni ca: ener- gia de activare exprimatS in calorii, energie necesara tuturor moleculelor unui mol de substantS, care la o anumita temperature sa atinga starea de tranzitie corespunzStoare apexului barierei energetice. Factorul ce asigurS desfa§urarea reactiilor in organismele vii la T°C interna constants este delimitarea la valori minime a energiei de activare. Viteza reactiilor e dependents de diferenta valorilor de energie libera (aG) pentru starea A (s) §i complexul de tranzitie. Ea este egala cu: aG = Gst - Gs. Se mai nume§te energie libera de activare — Gibbs.
Viteza reactiilor e proportionals cu numSrul de molecule, a cSror energie liberS este egalS sau mai mare decit aG. O datS cu cre§terea T,numarul moleculelor spore?te de 2 ori la 10° C. Enzimele accelereazS viteza reactiilor chimice (VRC), mic^orind bariera de activare, $i reactia decurge dupS alt mecanism, ce se caracterizeazS printr-o energie de tranzitie mult mai micS (fig. 1.15).
Formarea §i scindarea legSturii chimice de enzimS e precedatS de formarea complexului enzima-substrat [CES]. Substratul e fixat de o zonS restrinsS in enzimS, specifics,denumitS “centrulactiv”al enzimei. A§adar, ccntrul activ (CA) e o imbinare in tirnp $i spatiu a anumitelor grupe functionale, ce intra in legatura cu moleculele substratului $i determind activitatea catalitica a enzimei.
Dispunem de numeroase investigatii experimentale ce vizeazS formarea complexului enzima-substrat (CES):
1.Investigatii demonstrative prin intermediul microscopiei electronice ?i al analizei roentgenostructurale.
2. Formarea CES e insotitS
de modificSrile fizice ale enzimelor: solubilitate,
teimolabilitate.
3. Se modifies ?i caracteris- tica spectroscopicS, dacS in componenta enzimei intrS grupe prostetice colorante.
Figura 1.15. Diugruniu ce repreziitta energia libera de activare in reactiile chimice: S-substrat A; P-produs final B; ES $i EP- compuf intermcdiari.AGo - energia de reactie standard S~*~P
- 63-
4. Adecvata e §i metoda rezonantei electronice de spin (RES) sau rezonantamagnetica nucleara (RMN).
5. La formarea CES se manifests un grad mare de stereospecificitate (D - aminoacizii nu pot servi ca substraturi, nu se leaga cu enzima). Zona de legSturS are o formS geometries bine conturatS (fig. 1.16).
6. Uneori afinitatea mare a enzimei cu substratul A (in lipsa B) inlesne§te stabilirea complexului EA.
7. La concentratia constants a enzimei viteza reactiei spore§te o data cu mSrirea concentratiei de substrat, ajungind la viteza maxima.
In 1913, L.Michaelis a explicat notiunea de viteza maxima a reactiei fermentative fata de formarea CES. Concluzia ca viteza reactiei devine maxiina la concentratia mare a substratului, in conditiile in care acesta ocupa toate centrele active ale enzimei, e o argumentare inradacinata demult §i o dovadS Figura 1.16. Fixarea substratului in centrui concludentS a functionary complexului activ al cl"motr'Ps,"e‘ enzima-substrat.
Unele particularitati ale centrului activ (CA)
Centrui activ este alcatuit dintr-un “centru de legare” ?i un “centru catalitic”. Mai exact, in centrui activ unele grupari (sau resturi ale aminoacizilor) sunt implicate in legarea substratului, altele asigura cataliza propriu-zisa, fund “intercalate” ca grupe catalitice.
Enzimele confera o varietate structurala destul de mare, la fel de vaste sunt specificitatea $i mecanisinul actiunii catalitice. $i, totu§i, rezulta unele concluzii generale, referitoare la proprietatile lor:
1. CA ocupa o parte relativ mica din volumul enzimei §i majoritatea din restul aminoacizilor moleculei de enzima nu contacteaza cu substratul. E o enigma solicitarea unor dimensiuni atit de mari de catre enzime.
2. CA e o structure tridimensionala (nu e doar punct, linie sau plan) — structure complexa, la formarea careia participa grupe ale diferitelor resturi de aminoacizi (exemplu: instiucturalizozimului,dincei 129 de aminoacizi radicalii aminoacizilor din secventa liniara — 35,52,62,63,101 participa la formarea CA). Centrele active ale unor enzime sunt redate Tn figurile 1.17-1.18.
-64
Figura 1.17. Centrui activ al chimotripsinei
3. Substratul relativ slab se leaga cu enzima. Energia libera a interactiunii e de
3-12kcal/mol. Forta legaturilor covalente nu deviaza de la li mi tele 50-110 kcal/mol.
4. CA are forma de “adincitura” sau “cavitate” (§ant, despicatura), unde apa n- are acces, cu exccptia daca aceasta scrve?te drept reagent al reactiei. Aceasta cavitate confine citiva aminoacizi polari ce exercita legarea §i cataliza. Regiunca CA are un caracter nepolar ce favorizeaza fixarea substratului. De mentionat ca forma CA creeaza un microspatiu, in care resturile polare capata insu§iri deosebite, necesarc pentm cataliza.
5. Fixarea specifics e dependents de pozitia bine dcterminatS a atomilor in CA.
Substratul pStrunde in CA, cu conditia similitudinii de forma. In 1890, Emil Fischer a elaborat modelul “clasic” al structurii spatiale a CA in raport cu structura substratului. Anume acest principiu—' ‘lacat
-cheie” — a contribuit cu succes la evolutia conceptului catalizei stereospecifice (fig. 1.19).
Figura 1.18. Centrul uctiv al elaslazei
+
Figura 1.19. Formarea complexului enzima- substrut (ES) dupa modelul E. Fischer
In ultimii ani insa s-a constatat ca centrul activ nueo structura rigida cum presupunea E.Fischer, ci se modifica la fixarea substratului. Modeluldinamic, propus de D. Koshland, presupune o flexibilitate a zonei de cazare a CA in enzima libera. CA este preformat, ceea ce denota ca are o conformatic spatiala putin diferita de cea necesara fixarii substratului. Substratul induce o “modificarc conformationala” a zonei CA, realizind o configuratie optima fixarii (fig, 1.19a).
Unele enzime fixeaza substratul in forma lor tensionata, ce corespunde starii detranzitie.
Din punct de vedere termodinamic, situarea cea mai potrivita a substratului in raport cu enzima reduce la mi ni m gradele de libertate ale transiarii §i rotatiei substratului, ii mic§oreaza entropia, ceea ce favorizeaza obtinerea efectiva a starii de tranzitie §i motiveaza in mare parte scaderea energiei de activare a reactiei catalizate enzimatic.
E incontestabil faptul ca flexibilitatca stmeturii enzimei determina prezenta substratului in sfera de actiune a grupelor catalitice §i iesircaprodusului din acest sistem.
Figura 1.19a. Modificarile conformationale in molecula enzimei !a fixarea substratului (modelul D.Koshland)
-65-
Unele enzime indue o perturbatie a electronilor pe substrat, amplificind cu mult viteza catalizei (carboxipeptidazS).
Exists o varietate mare de factori ce influenteazd viteza reactiilor fermentative $i determina activitatea cataliticd a enzitnelor.
1. Concentratiafermentului:
a) in conditii standard, 2 molecule de enzime intr-o anumita perioadS de timp vor cataliza de 2 ori mai multe molecule de substrat decit o moleculS de enzimS V = R[E] — o relatie strict proportionals. La mSrirea concentratiei de enzima se observa devieri de la relatiile strict liniare—devieriimaginarece tin de metoda de studiu;
b) in prezenta mai multor enzime, viteza va fi limitatS de concentratia uneia dintre ele;
c) o data cu sporirea concentratiei enzimei, viteza unei reactii complexe se va mic$ora in cazul in care coenzima practic va fi legatS de o enzima inaccesibilS pentru celelalte;
d) adaosurile toxice pot fixa enzima. Numai dupS legarea lor, enzima va deveni aptS pentru activitate.
2. Concentratia substratului. Concentratia enzimei din tesuturi suportS variatii mici in timp (cu exceptia enzimelor “inductibile”), astfel incit ea poate fi considerate constants.
In schimb, concentratia substratului poate varia destul de mult conform stSrii metabolice a tesutului. Dependenta vitezei reactiilor de concentratia substratului constituie aspeclul cel mai important alcineticii enzimatice (fig. 1.20). Vo(nM/min)
Reprezentarea grafica reflects o 1 V|na^S^ V =V_
curba cu afinitati de hiperbola.
Explicarca ei se datoreazS lui L.Michaelis §i M.Menten. KM cste egalS cu concentratia substratului pentru care Vo prezintS ojumatate din Vnnx. Exprimarea KM se face in unitSti de concentratie §i se deduce din presupunerea de bazS precum cS factorul-limitS al vitezei reactiilor fermentative este scindarea complexului ES in produs §i enzimS.
Fiecare enzimS in parte are valoarea Km pentru substratul dat. Unele enzime (catalaza, carbanhidraza) cer cantitSti relativ mari de substrat pentru a atinge viteza egalS cu Vo; altele (hexokinaza) ating mSrimea datS la concentratii mici de substrat.
In conditiile de mediu al celulei, enzima nu-i saturatS cu substrat si nu functioneazS cu V Modificind concentratia
T * max. ’
substratului, c posibilS, in anumitS mSsurS, reglarea proceselor oxidative dincelulS.
3. pHoptim al fiecarei enzime, ce genereaza o actiune maxima a ei, nu coincide obligatoriu cu valorile pH caracteristice mediului intracelular al enzimei.
Figura 1.20. Variafiile vitezei reactiilor enzimatice in functie de concentratia substratului
Ecuatia lui Michaelis-Menten.
V [S]
max1- J
V =-
Km + [S]
- 66-
Marind sau mic§orind pH-ul mcdiului, se poate regia activitatea catalitica a enzimelor. Acest optim pH e dependent de gradul de ionizare a grupelor functional, al afinitatii enzimei cu substratul §i stabilitatii ei (fig. 1.21).
Ionii H+ ?i OH' au un efect denaturant asupra enzimelor — rup legaturile, ce determina structura tertiara. Daca in CA al enzimelor se afla grupari ionizabile, acide sau bazice, acestea interactioneaza direct cu ionii H+ §i OH;, rezultind cre§terea sau scaderea gradului lor de disociere §i actionind ca adevarati inhibitori ai enzimelor (amilaza in sucul gastric).
4. Influenta temperaturii (T) determina stabilitatea §i viteza de scindare a complexuluiES, influentindafinitatea enzimei la substratul activator sau inhibitor. Cre§terea vitezei reactiei o data cu cre§tcrea temperaturii este interpretata prin prisma “energiei de activare”. Pentru fiecare enzima se poate stabili o temperature optima, viteza atingind valoarea maxima. Cre§terea temperaturii cu 10°C pina la 40°C dubleaza in continuare viteza reactiei. Viteza scade din cauza distructiei enzimei, iar temperature inactivatiei enzimei coincide cu punctul de denaturare a proteinei (fig. 1.22).
Figura 1.21. Activitatea unor enzime in dependenta depH
Figura 1.22. Efectul temperaturii asupra activitatii enzimelor