EXPRIMAREA ACTIVITAtII ENZiMATICE

Pentru a exprima activitatea enzimei sunt necesari unnatorii factori: ecuatia sumara a reactiei; metoda de analiza; cofactorii enzimei, ionii sau coenzimele ei; valoareaConstanta dupa Michaelis; pH §i T°C optime.
In practica biochimica curenta sunt importante variatiile de activitate, $i nu activitatea absoluta. Se ia o anumita imitate arbitrara, care serve?te drept referinta.
- Unitatea Intemationala (U.I.) e acea activitate enzimatica ce asigura conversia a 1 jxmol de substrat intr-un minut in conditii standardizate de pH, T° C (25-30). Cofactorii §i alte conditii optime asigura actiunea enzimelor.
- Katalul (kat) constituie activitatea care asigura transformarea unui mol de substrat intr-osecunda (lmkat = 60U.I),(l U.I. = 16,67 nkat).
Semai utilizeaza:
- activitatea specified — numarul de U.I. cu referinta la Imgproteina;
- activitatea moleculara - numarul de molecule de substrat transformate de catre o molecula de enzima intr-o secunda — numarul turnover ( carbanhidraza - 36 milioane pe minut, catalaza - 40.000.000/sec.);
- activitatea oxidoreductazelor cu coenzima NAD+ sau NADP4^ se exprima prin cre$terea sau descre$terea extinctiei la 340 nm {absorb numai formele reduse). Ca imitate serve§te cre§terea sau scaderea cu 0,001 a extinctiei intr-un minut.
La reactiile fermentative ale metabolismului iau parte cnzimelc care se leaga cu moleculelc diferitclorsubstraturi. Exemplu:
E
Glucoza + ATP G!ucozo-6-P + ADP (E - hexokinaza)
Reactiile cu participarea a 2 §i maimultesubstraturiincludtransferulatomilorsau grupelor functionale de la un substrat la altul. Atare reactii decurg in doua moduri.
Primul tip de reactii — reactii de substitute unitara: 2 substraturi A $i B se leaga specific sau sporadic cu enzima, rezultind fonnarea complexului EAB cu scindarea lui in C §i D (fig. 1.23); al doilea tip de reactii — reactii ce decurg confonn mecanismului suhstitutiei duble (de tipul «ping-pong»). In astfel de reactii CA al enzimei in fiece moment leaga un substrat.
Figura 1.23. Reactii de substitute unitara
Aditionarea primului substrat e insotita de transfeiul giupei functionale pc enzima $i numai dupa eliminarea produsului fonnat din primul substrat poate sa aditioneze la enzima §1 al doilea substrat, dupa care sa reccptionezc giupa fimctionala:
AX + B —^ A + BX (fig. 1.24).
- 6 8 -
Figura 1.24. Reactii de substitute dubla
Amaccentuat ca enzimaaccelereazavitezareactiilorcatalizatede 108 - 1020 ori. Ureaza la pH = 8 §i T= 20 C mare§te viteza reactiei de 1014 ori.
Care este mecanismul ce atribuie enzimelor o activitate intensa in conditii atit de subtile?
Sunt antrenati 4 factori decisivi:
1. Apropierea ?i orientarea substratului de grupa cataliticd. Legatura chimica explorata a substratului se afla nu numai foarte aproape, dar ?i direct orientata fata de grupele catalitice. In consecinja, probabilitatea ca complexul ES va atinge starea de tranzitie se amplified.
2. Tensionarea $i deformarea sunt intr-o concordanta indusa: alipirea substratului produce modificari conformationale in molecula enzimei, tensionind structura CA, concomitent deformindu-se §i substratul legat, ceea ce favorizeaza atingerea starii de tranzitie a complexului ES. Apare concordanta indusa, adica modificari in structura tertiara §i cuatemara a molcculci enzimaticc.
3. Cataliza generald acido- bazica. in CA al enzimei conlucreaza grupe specifice ale resturilor de aminoacizi, servind drept donatori sau acceptori de protoni. Grupele acide §i bazice reprezinta catalizatori efectivi ai multor substante organice din solutiile apoase (fig. 1.25).
R2
<-C—Rl
.195
O
COO
SI-I;
OH; -NH
3 >
R2—NH,
HN
Nil
4. Cataliza covalenta. Enzimele reactioncaza cu substraturile, formind compu$i ES nestabili legati covalent, care in reactiile ulterioare formeaza produsul reactiei mult mai rapid decit in reactiile necatalizate. Compusul covalent e nestabil §i se hidrolizeaza mult mai rapid decit R.
RX + E- OH —^ R-OH + EX EX + HOH —*-
-69-
E-OH + HX
Enzimele stimuleaza diferite procese metabolice in celule, fiind organizate in sisteme (sau complexe) multienzimatice, in care enzimele activeaza coordonat. Ele genereaza rcactii succcsive ale unci anumite cai metabolice. Produsul primei reactii din astfel de sisteme devine substratpentru cealalta enzima.
Sistemele multienzimatice pot include 15 §i mai multe enzime, care activeaza intr-o anumita succesiune. In fiecare sistem exista un ferment cu rol de dirijor, care determina viteza tuturor reactiilor catalitice din lant, fiindca catalizeaza stadiul-limita, adica reactia cea mai lenta, ce determina viteza procesului in intregime. Enzimele de acest tip indeplinese nu numai fimetia catalitica, dar §i cea de modificator al propriei activitati (), ca respondente la diferite semnale.Carezultat, fiecare reactie metabolica i§i schimba viteza, fapt ce conduce la adaptari rapide. in conditiile noi apare oadaptare imediatd, de avarie. in aceasta categorie logic se include transformarea enzimei neactive in activa, sub inlluenta factorilor atit specifici, cit §i ncspecifici.
In majoritatea sistemelor multienzimatice fermentul-dirijor catalizeaza prima reactie din lantul lor consecutiv. Cantitatea suficienta de ceilalti fermenti determina activitatea catalitica intensiva, mdeplinind indicatiile dmjomlui §i intensificindu-§i activitatea la cre§terea cantitatii de substrat.
Enzimele, activitatea carora se gase.pe sub influenta unor semnale molecu- lare, sunt numite enzime reglatoare. Exista 2 clase de astfel de enzime: una — alosteric reglate (Alio stereos - alt loc) de modulatori ce se fixeaza necovalent, §i a doua — enzime ce se regleaza prin modificari covalente.
ENZIMELE ALOSTERICE. Ele poseda cu totul alt sau alte centre decit cel activ, in care sunt fixati liganzii. Ce le este caracteristic acestor enzime?
1. Poseda, ca §i toate enzimele, centru catalitic, unde se fixeaza $i se modifica sub- stratul, dar mai poseda un alt centru care are o pozitie spatiala pentru fixarea metabolitului reglator, numit efector sau modulator. Acest centru e specific pentru fiecare modulator.
2. Moleculele enzimelor alosterice sunt mai mari, mai complexe §i primordial oligomerc pare.
3. Aucinetica lor — viteza reactiilor, in dependenta de concentratia substratului, are forma sigmoidala, dar nu hiperbolica, cauzata de urmarile interactiunii intre protomeri ce leaga substratul in mod cooperativ (exemplu — mioglobina §i hemoglobina—fig. 1.26).
Exista 2 tipuri de enzime alosterice:
a) homotrope in care modulatorul §i substratul constituie aceea§i substanta.
Acumularea substratului activeaza viteza rcactiei catalizate dc aceasta enzima:
Mioglobina
Figura 1.26. Curbele de oxigenarc ale mioglobinei (Mb) $i hemoglohinei (Hb)
-70-
Hexokinaza
Glucoza + ATP —»- G-6-P + ADP
(de altfel, ca §i alcoolul ce activeazS enzima ce il scindeaza - alcooldehidrogenaza);
b) heterotrope — enzimele sunt reglate de 4 modulatori care diferS dupS structurS de i substrat, multi dintre ei avind actiune antipodS.
La fixarea modulatorului, enzimele alosterice i§i modifies conformatia. Modulatorii accelereazS sau inhibS utilizarea substratului de enzima respective (fig. 1.27).
Unele sisteme enzimatice manifests 0 parti- cularitate deosebitS: produsul final al sistemului inactiveaza enzima—un rezultat al activitStii mai
productive a sistemelor multienzimatice, decit e necesar celulei. Acest produs final actioneazS ca un inhibitor specific al primei enzime §i, ca rezultat, viteza sistemului se echili- breazS in corespundere cu cerintele celulei - retroinhihi- tie sau inhibitie prin produs final, inhibitie de tip feed back. TransformSrile L-treonina —L-izoleucina necesitS 5 enzime. Prima enzima e treonindehidrataza, inactivatS de izoleucinS, modulator ce se fixeazS in CA. Este un exemplu clasic de reglare necovalentd §i e reprodus in fig. 1.28.
Se inregistreaza enzime reglatoare, labazaactivarii carora se atesta modificari covalente ale moleculei:
E
Glicogenn + P —Glicogenn, + Glucozo-l-P
coo
h3n-c-h
H-C-OH
ch3
L-treonina
r
. Treonin :i dehidrataza
pozitivi (+) $i negativi (-) asupra cinelicii reacfiilor catalizale de enzimele alosterice
1 D
i E,
1
1
COO-
] H3N-C-H
v—H-C-CH,
.... CH2
L-izoleucma |
CH3
Figura 1.28. Inhihitia de tipul feed back. Conversia L-treoninei in L- izoleucina catalizata de o succesiune de enzime. Treonindehidrataza Et este inhibata de produsul final
Enzima fosforilaza A (forma activa constiluie un dimer compus din 2 protomeri idcntici, fiecare avind rest specific de serina, fosforilat pe grupa OH) catalizeaza reactia. Fosfataza fosforilazei catalizeaza hidroliza legaturii P cu serina §i transfers F «A» in F «B» mai putin activS. Kinaza fosforilazei catalizeazS transferul grupei P de la ATP la OH serinei $i reactiveazS activitatca enzimei (“B” —^ ”A”) (fig. 1.29).
Trecerea dintr-o fonnS in alta e insotitS de modificari ale structurii cuatemare ce atinge centrul activ, regleazS activitatea enzimei. Asocierea protomerilor “B”activeazS “A”.
Reactiile catalizate de enzimele alosterice sunt ireversibile, au AG - negativS. Exists §i alte modificSri covalente ale enzimelor — metilarearesturilordeami- noacizi, aditionarea adenilatului etc.(lig. 1.30).
La unele enzime foarte complexe activitatea poatc fi reglata atit covalent, cit §i necovalent.
O categorie de enzime sunt sintetizate in forma neactiva de precursor, care se activeaza la o proteoliza limitata (proenzimele). Exemplu:
1) enzimele digestiei ce scindeaza proteinele in stomac §i duoden - pepsinogenul, chimotripsi- nogenul, tripsinogenul, proelastaza, procarboxi peptidaza;
2) coagularea singelui e determinate de avalan$a de reactii cu actiune proteolitica;
3) hormonii proteici (insulina);
4) proteinele fibrilare (colagenul).
Exista o grupa de proteine-enzime, starea activa a carora e conditionata de impachetarea spontana a moleculelor cu formarea unei structuri tridimensionale caracteristice enzimei date (lizozim).
Fosforilaza B
Fosfataza
fosforilazei
2P:
y-2H.O
Kinaza
fosforilazei
Figura 1.29. Reglarea activitatii glicogen fosforilazei prin modificarile covalente
Modificarile covalente Resturile de aminoacizi accep-
p, tati in modificarile covalente
ATP ADp 'll
^ Pn7— fi
Tyr, Ser, Thr, His
Fosforilarea
Enz
Enz
Adenilarea
ATP PPi
- Enz— P— O I- O
o
Enz—P—O CH 2 o Adenina I '
O'
Tyr
UTP
PPi
0
OH OH
Enz
ADP-ribozilarea
Enz
Uridilarea
NAD Nicotinamida
•Enz-P-O-CH, O. Uracilul
4- ft vl
/ H
Tyr
OH OH O
I?
Enz O^ CH2-0-P-0-P-0-CH
H>_f H
OH Oil
I
O
o
0 Adenina
i
S-adenozil S-adenozil
Metilarea metionina homocistcina
Enz
—Enz— CH 3 Figura 1.30. Exemple de modificdri covalente ale diferitelor enzime
OH OH Arg, Gin, Cys
Glu
- 1 2 -
Figura 1.31. Modelul simetric defixare cooperativa a substratului
Inhibitor alosteric
in 1922 Al. Fleming descopera, intr-un mod deosebit, lizozimul, iar in 1929 tot dinsul descopera §i pcnicilina.
Mccanismul interactiunii alosterice
In 1965 savantii J. Monod, J. Wyman, J. Changeux au propus un model fin ?i clar al interactiunilor alosterice (MWC)
— modelul simetric sau “concert trat”, avind urmatoa- rele caracteristici cardinale (fig. 1.31):
1. enzima alosterica este compusa din 2 subunitati identice, simetrice, cu un centru activ, centrele fund echivalente;
2. enzima (oligomcrul) poate exista in doua stari: T- tensionata (constnnsa), cu afmitate mica de substrat, §i R- relaxata, cu o afmitate mare de substrat;
3. conformafia fiecarui monomer este constrinsa de asocierea cu ceilalti monomeri;
4. formele T §i R pot trece din una in alta §i se afla in echilibm T —^ R;
5. pentru acest model se face o exceptie: intru a pastra simetria dimerului, ambele subunitati trebuie sa adere la aceeafi conformatie.
in lipsa substratului, toate molcculele se afla in forma T (la 104 molecule — o molecula poate capata forma R).
Prezenta substratului modifica conformafia, ducind la aparitia formei R. Cind substratul se leaga cu centrul activ, celalalt la fel trebuie sa se afle in R - stare. Treccrea de la T la R §i viceversa se produce coordonat. La aditionarea substratului partea moleculara a enzimei in starea R progreseaza §i fixarea substratului devinc cooperativa. La o saturatie completa toate moleculele enzimei se fixeaza in R stare.
Inhibitorul sc leaga cu forma T, activatorul — cu fonna R, astfel efectele homotrope devin pozitive, iar cele heterotrope
— pozitive sau negative (fig. 1.32).
D.Koshland, G.Nemethy §i D.Filmcr (KNF) propun modelulseevential, mai clasic (fig. 1.33). Baza lui constituie trei postulate:
1. fiecare monomer poate exista in una din conforma- tiile posibile - T sau R;
2. fixarea substratului modifica forma doar a unei subunitati, cealalta nu sufera modificari vadite;
3. modificarile conformationale determinate de substrat la o subunitate pot mari sau mic§ora afinitatea la substrat a celorlalte subunitati. Fixarea este cooperativa.
Deosebirileintre modcle: cel simetric nupresupune echilibruintre formele R 51 Tin lipsa substratului, dar din contra, fixarea substratului induce trecerea T —► R.
FonnaT
Activator alosteric
Forma
Figura 1.32. Inhibitorul alosteric stabilizeuza forma T, pe cind activatorul respectiv —forma R
-73-
s
l
In accst model esentialS este simetria monomerilor.
Modelul seevential denotS cS trecerea de la T la R in diferite subunitSti are loc coordonat §i intr-o anumitS succesiune. Un rol primordial are fonna hibrid RT. Monomerii interactioneazS cu conditia prezentei fbrmei confonnationale diferite. Inultimul model (seevential) efectul substantelor homotrope poate fi pozitiv $i negativ. FixareadeenzimSa douS molecule de substrat depinde efectiv de natura modificarilor stxucturale, determinate de fixarea primei molecule de substrat.
Recent se considers ca aceste modele reprezintS doua cazuri aparte de interactiune. In realitate ea e mult mai complexS, dependents de particularitStile structurii cuatemare, tertiare etc.
E stabilit ca sub actiunea guanidinhidroclorurei (G4HC1) sau a ureei inactivatia unor enzime are loc la concentratii relativ mici ale agentilor denaturanti, in care nu se observS modificSri globale in conformatia moleculei. Studiile recente confinnS ca pierderea activitStii fennentative e detenninatS de mic§orarea mteractiunii in Figura 1.33. Modelul molecule ce are, drept consecintS, cre§terea mobilitStii pSrtii ei seevential de fixare lSuntrice. §i denaturarea tennica prezintS date ca pentru un §ir de a Sllh'
enzime inactivarea este antecedents modificSrilor confonnatiei, care este indusS de T inaltS. Pierderea activitStii enzimatice in acest caz nu e provocatS de efectul inhibitorilor. Posibil cS enzimele oligomere (creatin kinaia), disociind la monomeri, ar putea sS se inactiveze in lipsa vSditS a desfa§urSrii moleculei enzimatice. Observatiile denotS cS disocierea creatin kinazei are loc la concentratii ale agentului denaturant, cu mult mai majore decit ale celor ce provoacS inactivarea enzimei.
Studiile actuale deinonstreazS cS mic§orarea activitStii enzimatice in conditii de concentratii relativ mici ale agentilor denaturanti sunt cauzate nu de efectul lor inhibitor sau de disociatia enzimelor oligomere, dar de dependenta deperturbarea confonnatiei centrului activ.
Datcle experimentale elucideazS cS centrele active ale majoritStii enzimelor sunt situate in regiuni ale moleculei mult mai mobile (intre domenii) §i deci sunt mult mai sensibile la actiunea agentilor denaturanti sau a factorilor fizici. In confonnitate cu ipoteza “potrivirii induse" a lui D.Koshland, in fiecare fazS a ciclului catalitic regiunea centrului activ capStS o confomiatie specifics fazei. Activarea enziiuei este rezultatul coaptSrii CA a confonnatiei, perfecte, ce detenninS efectul catalitic maxim. Darin caz de sporire a activitStii enzimatice la incSlzire §i proteolizS, are loc trecerea dintr-o conformable compacts §i stabilS in alta relativ mai deschisS $i structuratS mai fin. La proteolizS limitatS activarea zimogenului e cauzatS nu de coaptarca CA a confonnatiei perfecte cu tnodificSri fine in trecerea de la conformatia zitnogcnului la cea neccsarS pentru catalizS, dar de majorarea mobilitStii moleculei proteice in regiunea CA. Anume flexibilitatea, dar nu structure bine formats a centrului activ, e responsabila pentru fiinctia catalitica.