STRUCTURA PRIMARA

Cum se leaga aminoacizii in proteine? Procesul decurge in felul urmator: a-grupa carboxilica a unui aminoacid se une§te cu a -aminogrupa altui aminoacid, fonnind legatum peptidicd, cu eliberarea unei molecule de apa.Echilibrul acestei reactii inclina mai mult spre procesul de hidroliza, dar nu de sinteza.
De aceea procesul de sinteza necesita energie, pe cind hidroliza dccurgc cu degajarea ei. La unirea multor aminoacizi cu legaturile peptidice se formeaza un lant (catena) polipeptidic, avind o structura liniara.
Lantul are o anumita directie. S-astabilit conditional ca el incepecu capatul purtator de aminogrupa, capatul N. Descrierea unci sccvente de aminoacizi in lant incepe anume de la acest capat terminal. Aminoacidul, care in legatura peptidica participa cu grupa sa COOH, capata sfir$itul - il; aminoacidul final, care contine grupa COOH libera, nu-$i schimba denumirea, formindcapatul C-terminal.
A§adar, lantul polipeptidic are un schelet cu o structura stricta, repetata §i catene laterale diferite.
Succesiunea aminoacizilor determina structuraprimara a proteinelor, fund baza informatiei genetice. In unele proteine catenele laterale se unesc intre ele cu legaturi disulfidice, care se formeaza la oxidarea resturilor de cisteina. Alte legaturi covalente in structura proteinelor nu se intilnesc. Astfel de tip de legatura intre aminoacizi in molecula proteica 1-a stabilit, in 1888, savantul rus A. Danilevschi;darnumaiin 1902E.Fischera inaintat teoriapolipeptidica. Azi §tiinta poseda argumente convingatoare ale prezentei acestei stmeturi:
1. Analiza roentgenostructurala a permis h N—C__NH—C—NH
detenninareatabloului repartitiei resturilor de aminoacizi
in lantul polipeptidic §iconformatialui. O O
2. Argumentarea de baza este posibilitatea de Biuretul
sinteza a proteinelor purificate, precum §i a
polipeptidelor cu structura cunoscuta, care poseda activitate biologica, la fel ca §i proteinele native.
3. Proteinele, ca §i compusul biuret, dau o coloratie albastra-violeta in prezenta CuS04, in mediu alcalin, ceea ce e o dovada a prezentei legaturii peptidice.
Ficcare proteina are o structura unica, o succesiune precisa de aminoacizi. In 1953, Frederic Sanger dcscifreaza aminoacizii in lanturile polipeptidice ale honnonului - insulina. Prima data a fost determinata succesiunea aminoacizilor, stabilindu-se ca aceasta e detenninata genetic. Sinteza tuturor proteinelor din aminoacizi are mecanism similar.
Care este necesitatea detenninarii acestor succesiuni in proteine?
Avem posibilitatea de a stabili:
1. Baza moleculara a activitatii biologice a proteinelor.
2. Principiile ce stau la baza fonnarii lantului polipeptidic - la actiunea biologica activa alcatuesc stmeturi specifice bazale.
3. Modificarile In succesiunea aminoacizilor pot conduce la tulburari ale functiei pro- teinelor §i, in consecinta, la aparitia maladiilor. De mentionat ca modificarca unui singur aminoacid provoaca tulburari grave in metabolism. Evolueaza o directie noua in medici- na - patologia moleculara.
4. Succesiunea resturilor de aminoacizi fumizeaza informatii sugestive despre evolutia procesului la nivel molecular.
Care sunt principiile de descifrare a succesiunii aminoacizi lor?
1. Protcina trebuie sa fie hidrolizata pina la aminoacizi, incalzind-o la 110°C timp de 24 ore in 6 N HC1. Hidrolizatul e separat prin metoda cromatografiei ionice cu polistcrol sulfonizat. Aminoacizii ifactionati se determina prin reactia cu ninhidrina: a-aminoacizii confera o culoare albastra intensiva, prolina (iminoacid) - galbena.
Metoda aplicata este deosebit de efectiva. Cantitatea de aminoacizi e proportionals densitatii optice a solutiei dupa incalzire cu ninhidrina.
Daca cantitatea de aminoacizi este minima, se fo\ose$te fhiorescamina. Comparind rezultatele obtinute cu amestecul standard, determinam compozitia aminoacidica a proteinei §i anume: compozitia, nu insa succesiunea aminoacizilor.
2. Procedeul de identificare a terminalelor N §i C a fost utilizat de F. Sanger pentru stabilirea grupei NH, de catre dinitrofluorbenzen, cc reactioncaza cu NH2, formind compu§i (de culoare galbena) ai acestei substante. Legatura e stabila §i se pastreaza la hidroliza legamrii peptidice; compusul e determinat cromatografic.ResturileC-terminate ate catenelorpolipeptidice se identifies in felul urmStor: polipeptida se incubeaza cu carboxipeptidaza (COP), care hidrolizeazS legStura peptidica la capStul C-terminal, compusul fiind determinat cromatografic. Carboxipeptidaza-AesteinactivSlaCOOHaleargininei, lizinei §iprolinei. Carboxi- peptidaza-B scindeazS COOH ce apartine lizinei §i argininci.
Metoda chimicS: proteina se incubeaza cu hidrazinS la 100()C, in lipsa apei, rezultS hidrazide ate aminoacizilor, excluzindCOOH-tenninal, care ramine liber. Acestaminoacid este identificat cromatografic.
Un alt principiu constS in scindarea lantului polipeptidic in fragmente, explorind diferite metode:
a) hidroliza cataliticS limitatS sub actiunea enzimelor specifice - tripsina (scindeaza legaturile peptidice formate de grupa COOH a Lys §i Arg, indiferent de lungimea §i succesiunea aminoacizilor in lant);
b) metode chimice specifice, de exemplu, bromura cianidica (CNBr) scindeaza legatura peptidica formats de COOH a metioninei. AceastSmetodSepreadificilS.
Peri Edman propune metoda de determinare a succesiunii fragmentelor peptidice sau aminoacizilor. In metoda elaboratS de F.Sanger hidrolizatul nu poate fi folosit dublu din cauza cS peptida se hidrolizeazS complet.
Peri Edman a reu§it sS marcheze capStul N-terminal $i scindarea lui de la peptid, producindu-se farS scindarea altor legSturi peptidice. Metoda constS in scindarea fiecSrui rest de aminoacid din capStul N-terminal. In acest caz se fo!ose§te fenilizotiocianatul care reactioneazS cu NH,, rezultind fonnarea feniltiohidantoina compusului:
in mediu slab acid are loc disocierea compusului ciclic, iar peptida ramasa e mai mica cu un rest de aminoacid. Produsul este identificat cromatografic. Degradarea dupa Edman este repetata.
In fine, se ajunge la etapa in care succesiunea in fragmente de peptide e clara, dar nu e identificata succesiunea peptidelor inse$i. Ultimele se determina dupa suprapunerea difcritclor scgmentc de peptide, stabilindu-sc astfcl segmentele de coincident^. Se folosesc §i alti fermenti ca: chimotripsina (scindeaza legatura peptidica formata de COOH a Phe, Tyr $i Trp),pepsina etc.
Metodele descrise mai sus se refera la proteinele compuse dintr-un singur lant polipeptidic, fara prezenta legaturilor disulfidice. in caz contrar, sunt necesare metode suplimentare. Disociatia a mai multor catene polipeptidice e posibila sub actiunea detergentilor ca: ureea, hidroclorura de guanidina, care scindeaza legaturile necovalente, distrugind structura tertiara §i cuatemara.
Analiza structurala a protcinei poate fi accelcrata prinutilizarcasecventiatorului - aparat ce permite detcnninarea automata a succesiunii de aminoacizi.
Proprictatile functionale ale proteinelor suntdetenninatedeconfonnatic,aranjamcntul spatial al atomilor, esentiala fund succesiunea de aminoacizi, care, defapt, §istabilc§te confonnatia proteinei.
La sfir?itul anilor 1930 L.Pauling §i R.Corey au inceput explorarea structurii aminoacizilor $i a peptidelor cu raze X §i au determinat lungimea §i unghiul standard ale legaturilor, ca apoi sa prevesteasca conformatia proteinei. S-a constatat un fapt important, §i anume: unitatea peptidica poseda o structura planica rigida. Atomul de hidrogen al grupei NH, ocupa o pozitie trans in raport cu O, a grupei carbonilice (fig. 1.1).$i, deci, rotirea in jurul
acestei legaturi este ingreuiata. Lungimea ei este de 1,32A, media lungimii dintre legaturile ordinare C-N §i legatura dubla C=N. Spre deosebire de cazul examinat, legatura dintre atomul de C §i atomul de C al grupei carbonilice este ordinara. Prin urmare, in ambele parti ale legaturii peptidice rigide gradul rotirii libere este foarte mare. Fiecare aminoacid e caracterizat prin unghiurile sale de rotire. Rotirea fata de aceste legaturi se noteaza prin unghiurile \(/ $i <j) (fig. 1.2).
In concluzie, structura primara nu este altceva decit succesiunea de aminoacizi in proteina §i localizarea puntilor disulfidice.
Ea reprezinta o caracteristica completa a legaturilor covalente din proteina.