FOLDINGUL. PROBLEMA IMPACHETARII SPECIFICE A LANTULUI POLIPEPTIDIC

Au trecut mai mult de 40 de ani de la descoperirca §tiintifica a lui C. Antinsen, dar $i acum sute de savanti studiaza problema impachetarii specifice a lantului polipeptidic.
S-a dovedit ca a prezice conformatia proteinei in baza succesiunii de aininoacizi (tinind cont de proprietatile lor, de solubilitatea in apa) nu e atit de simplu. Problema are §i aspect practic: paralel cu dezvoltarea biotehnologiei $i in baza reconstruirii genelor se poate asigura sinteza noilor proteine.
S-a stabilit ca la impachetarea unor proteine imense iau parte §i proteinele mult mai mici, numite ciaperonine, ce se intilnesc in bacterii, citoplasma celulelor eucariote, matrixul mitocondrial. Sunt compuse din 2 elemente ce aparfin diferitelor familii proteice - lisp 60 (Gro EL) §i Hsp 10 (Gro ES), mai substantial sunt studiate ciaperoninele la E.coli.
Gro EL e constituit din 14 subunitati idcnticc, protomeri cu masa moleculara 57 kDa (548 resturi de aminoacizi), ftecare aranjati simetric cite 7. Analiza rocntgcnostructurala a descifrat structura spatiala a complexului. Fiecare protomer e compus din 3 domenii - eucatorial, apical §i intennediar.
-35-
Gro ES (co-ciaperoninele) sunt compuse din 7 protomeri identici aranjati simetric, masa moleculara a protomemlui e de 10 kDa §i confine 97 resturi aminoacide. Structura spatiala a protomerului prezinta un nucleu de (3-structura plianta inconjurata de inici structuri de a-elice (fig. 1.13).
Fiecare protomer in ciaperonine poate fixa cite o molecula de ATP. Au fost determinate locusurile functional, unde are loc fixarea ATP, a polipeptidului substrat §i a Gro ES in Gro EL. Sunt constatate particularitatile ciclurilor reactibile in ciaperonine la fonnarea complexului activ functional §i fixarea substratului polipeptidic. Suntpropuse diferite modele ale complexului, posibilele mecanisme de functionare §i asamblare a protcinelor prin ciaperonine.
Complexul ciaperoninelor poseda activitatea ATP-azica, se presupune ca complcxul functional activ e obligat sa asigure conditiile cinetice primare pentru asamblarea proteinei in afara ribozomului, in portiuni mai indepartate in citozolul celulei, S-a constatat ca fonnarea complexului activ necesita ionii de K+. Sunt date experimentale ce confirma ca in vivo asamblarea lantului polipeptidic inproteina activa are loc cotranslational, adica in acela$i timp cu sinteza lantului in ribozom.
Cum are loc procesul de autoimpachetare a proteinelor?
Lanturile polipeptidice desfa§urate sau proaspat sintetizate sunt numite ghemuri dezordonate. Studiul asupra proteinei denaturate a stabilitca in interiorul ei apar regiuni rasucite, asociate intr-un mod anume §i diferite de intreaga molecula. Accste substructuri (subdomenii) sau numai unele dintre elc sunt nestabile, fluctuante, scrvind in calitate de detonant (fitil), in jurul carora se fonneaza regiuni stabile structurale.
Despre starea denaturata a proteinei se §tie mult mai mult decit despre cea desfa- §urata. Una din primele legitati ale impachetarii consta in faptul ca contactui dintre moleculele de H,0 §i aminoacizii hidrofobi trebuie, pe cit e posibil, sa fie minim. A doua legitate: globula proteica urineaza sa fie impachetata compact, insa spatiul ci trebuie sa fie umplut astfel incit atomii invecinati sa nu se intercaleze.
La momentul actual se disting doua conceptii:
Prima, mai putin pronuntata, este cea care presupune ca lantul polipeptidic colapseaza rapid pina la dimensiunile finale ale globulei, cu ie^irea aminoacizilor hidrofobi din contactui cu apa. in starea data molecula se reorganizeaza rapid, capatind proprictatile ei de structura secundara §i tertiara (datele experimentale confirma aceasta teorie).
A doua conceptie, mai reu§ita, stabile§te ca lantul polipeptidic desfa$urat foarte rapid formeaza segmente constante, limitate de structura secundara. Ele interactio- ncaza $i temporar se realimenteaza reciproc. Segmentele stabilizate, microdomeniile respective transforma conformatia moleculei proteice in directia organizarii supreme prin asociere cu alte segmente, favorizind contactele dintre segmentele indepartate. In stadiilc tranzitorii se fonneaza intermediate, structuri ce pot fi determinate foarte greu, dat fiind existenta lor de scurta durata.
Caracteristica structurilor vizate:
a) au dimensiuni mai mari decit molecula nativa §i poseda elemente fonnate de structura secundara;
-36-
protcinei
(b)
Figura 1.13. Ciaperoninele in foldingul proteinelor:
(a) mecanismul de actiune a ciaperoninelor E.coli GroEl (apartinc familiei proteinelor IIsp60) $i GroES. Fiecare complex GroEL poseda 2 site-uri formate din 2 inele heptamerice (masa moleculara egala cu 57 000 Da). GroES este, de asemenca, heptamcr (masa moleculara egala cu 10 000 Da) §i poatc bloca unul din site-urilc GroEL.
(b) suprafata §i scctiunea complexului GroEL/GroES. In imaginea sectiunii sc vede spatiul intern al complexului, in interiorul caruia se aniplascaza alte proteine.
- 3 7 -
b) savantii au desfa§urat proteina nativa si apoi au realizat impachetarea, oprind-o la diferite etape; au identifical intermediatelc dupa formarea legaturii S-S, ce apareau in procesul de impachetare $i apoi dispareau pe neobscrv'atc in molecula nativa.
S-a demonstrat ca unele fragmente formeaza asociatn temporare, altele stabile, §i se pastreaza in globula nativa, avind un rol fundamental la initierea procesului dc impachetare a lantului. Intermediatele au fost studiate prin metoda izotopilor. Hidrogenul din grupele pcptidice a fost inlocuit cu deiteriu prin incubatia lantului polipeptidic in apa grea. Apa grea substituita apoi cu cea obi§nuita favoriza includerea hidrogenului in legaturile neformate, §i in continuare, procesul avansa pina la finisarea deplina. Identificarea regiunilor cu deuteriu a developat fragmentele moleculelor ce se impachetau in primul rind. A§a s-a stabilit consecutivitatea formarii intermediatelor. S-a confirmat ca in citocromul C are loc asocierea primara a doua spirale in capetele opuse ale lantului polipeptidic. in ribonucleaza, la inceput, se formeaza (3-structura situata in centrul moleculei.
impachetarea poate fi determinata $i prin metode matematice, cu utilizarea functiei energiei potentiate. In computer se introduc valorile in ciffe care caracterizeaza fortele de atractie intre perechile de atomi ai moleculei din lanturile polipeptidice. Apoi se iau coordonatele atomilor la care energia totala a moleculei se mic§oreaza pina la minim (in eventualitatea ca structurile finale au energie minima). Studiile recente elucideaza posibilitatea precizarii structurii tertiare dupa succesiunea aminoacizilor. O serie de investigatii confirma faptul ca pentru impachetare sunt necesari factori spatiali §i interactiune hidrofoba. Rolul diferitelor forte variaza de la o proteina la alta. E posibil ca fortele electrostatice joaca un anumit rol la stabilizarea conformatiei finale, dar nu §i la fomiarea ei.
Rezultanta finala a foldingului este confonnerul nativ ce poseda activitate biologica. Un doineniu cu o structura stabila secundara care se formeaza primar, comparativ cu cealalta parte a moleculei, e numit foldon.
Asamblarea proteinelor se considera un proces fizic de o valoare biologica deosebita. Modelarca computerizata a procesului confirma ca asamblarea demareaza de la lantul desfasurat care fluctueaza mult timp fara formarea unor contacte native esentiale. Apoi lantul atinge intimplator starea in care persista un ansamblu de contacte native. Dupa aceasta situatie, procesul de asamblare decurge foarte rapid pina la starea finala - fonnarca structurii native.
Se considera ca un pas-limita in asamblarea acestor catcnc cste formarea primara a unui complex de contacte native (nivelul asamblarii), care, fulgerator, influenteaza toata molecula. Acest nucleu nu e identic cu starile intermediare. S-a consolidat ideea ca:
a) asamblarea incepe cu formarea unui complex detenninat de contacte native;
b) resturile ce se ihclud in acest nucleu sunt aranjate la diferite distante in lant.
Studiile au stabilit ca nucleul asamblarii este constituit din rcsturi nefunctionale
mai conservative - proteinele legate evolutiv poseda 2 complexe de resturi conservative: unui pentru centrul functional §i altul pentm nucleul de asamblare.
Asamblarea eonfonn conotatici «totul sau nimic» corespunde mecanismului nucleatiei $i cre§terii §i c tipica pentru proteinele foarte mici. Asamblarea proteinelor majore trecc
-38-
prill stari intennediare. Una dintre ele este §i globula in fuziune ce sc caracterizeaza prin stare intermediara compacts cu structurS nativS asemSnStoare, dar farS structurS tertiara rigidS, prin lipsa de cooperativitate la temperatura de topire §i mi§cSrile intramoleculare rapide. O stare asemanatoare e proprie §i intcrmediatelor.
S-a demonstrat cS in globula in fuziune, molecula proteicS pSstreazS unelc particularitSti ale topologiei native (aranjarea reciprocS a a §i (3 structuri), aranjarea rigida a catenelor proteice. Aceasta clasifica globula ca intermediat intre catena desfa§urata §i starea nativa, stare termodinamicS intre cele douS. Se presupune ca molecula proteica poate exista in trei stari: nativa, globula in fuziune $i cea desfa$urat5.
S-a stabilit ca globulele in fuziune, genetic, sunt un intermediat universal pentru asamblarea protcinelor.
A$adar, prin folding se subintelege aranjarea spatiala corecta de novo a catenei proteice, iar refoldingulpresupune aranjarea spatiala dupd denaturare.
Studiile contemporane confirms ca proteinele auxiliare pot fi impSrtite in 2 grupe: ciaperonine moleculare §i enzime. Prima grupa constituie o clasa functionala de proteine neomogene, care favorizeaza asamblarea corecta necovalenta a altor structuri polipeptidice in vivo, nefiind componente ale acestor structuri organizate, ce ii indcplinesc functiile biologice. Sunt evaluate multe proteine cu functii asemanatoare - proteinele §ocului termic formeaza o grupa mare de ciaperonine.
Enzimele denumite foldaze catalizeaza modificarile covalente, strict necesare la formarea confonnatiilor native functionale ale diferitelor proteine. Deocamdata sunt idcntificate 2 enzime ca foldaze -proteindisulfidizomeraza (PDI) ce catalizeaza formarea legaturilor native disulfidice §ipeptidil-prolil-cis-trans-izomeraza (PPI) ce catalizeaza izomerizarea unor legaturi stabile trans-peptidil-prolil in cis-confonnatie, necesare pentru asamblarea functionala a proteinelor. Ambclc sunt rcactii covalcntc, rcactii-limite in etapele foldingului proteinci corcspunzatoarc. Procesul de Folding §i formarea disulfidelor native sunt procese strins legate intre ele §i decurg simultan.
S-a constatat ca PDI prezinta nu numai o izomeraza ce catalizeaza formarea legaturii disulfidice in peptidele sintetizate, dar §i o ciaperonina moleculara, ce participa la procesul foldingului catenelor. Activitatea ciaperoninica nu e dependents de cea izomerazica. Functionind ca foldaza in procesul de folding, este necesara atit activitatea izomerazica, cit $i cea ciaperoninica.