Proteinele sunt compu$i macromoleculan cu proprietati hidrofile, adica sunt solubile. Aceasta inspire se datoreaza repartizarii pe suprafata moleculelor a resturilor de aminoacizi cu sarcini electrice sau a grupelor polare. Proteinele fibrilare sunt insolubile in apa, pe cind cele globulare atesta grade diferite de solubilitate.
Solubilitatea proteinelor
Solubilitatca in apa este putemic influcntata de diverse sarari ale metalelor u$oa- re: NaCl, MgCl,, Na2S04, (NH4)2S04. In concentratii mici ele au un efect favorabil. De exemplu, globulinele sunt greu solubile in apa pura §i se dizolva u?or numai in solutii saline diluate. Efectul nu depinde de natura sarii, dar de concentratia ei §i de numarul de sarcini ale fiecarui ion din solutie. Mai eficace sunt sarurile ce contin ioni bivalenti (Mg), fata de cele ce au ioni monovalenti. Solubilitatea marita e determinate de cre$terea gradului de disociere a gmpelor ionizate in proteine.
In concentratii foarte mari sarurile amintite reduc solubilitatea proteinelor pina la precipitarea lor din solutie - salifiere. Procesul e mai efectiv in punctul izoelectric al proteinelor. Mecanismul e complicat: ionii de sare atrag moleculele de apa polarizata, mic§orind cantitatea de apa ce interactioneaza cu proteina, cauza fiind concentratiile mari de sare in care numarul ionilor este imens fata de numarul grupelor cu sarcina a proteinei. Dar avind in vedere ca solubi 1 itatea proteinelor in apa este dependents de foirnarea membranei apoase in jurul grupelor ionice hidrofile, transferal molecular de apa la alti ioni mic§oreaza solubilitatea proteinei. Procesul decurge mai rezultativ atunci cind toate operatiile se efectueaza la temperaturi joase, in conditiile in care proteinele sunt mai stabile.
Diferite proteine se salifieaza la diferite concentratii de sarari — fenomen ce este utilizat pentra fractionarea lor. Globulinele precipita cind solutiile care le cuprind sunt aproximativ semisaturate in (NH4)2S04, pe cind albuminele precipita la concentratii mai mari — de 75% saturatie.
Procesul de salifiere a proteinelor in multe cazuri nu e legat de pierderea capacitatii proteinei de a se resolubiliza dupa inlaturarea agentului. Eliminarea prin dializa a (NH4)2SO, sau Na - sulfat complet conduce la resolubilizarea in apa a proteinei salifiate cu formarea solutiilor adeevate. Capacitatea de resolubilizare rapida se mentinc §i in cazul inlaturarii imediate a proteinei de la salifiat (alcool): proteina i$i pastreaza proprictatile native.
Solutiile in apa a proteinelor au un caractcr coloidal. Diametral unor astfcl de particulc e de la 1 la 100 nirac. Remarcam solutii reale:
a) ionice—particulclc sunt mai mici decit 1 mmc, disociaza in ioni, conduc curentul electric;
b) moleculare—se descompun pina la molecule, nu disociaza $i nu conduc electricilatea (glucoza, alcoolul)—dau spatiu optic nul.
Daca particulelc sunt mai mari de 100 mmc §i substanta famine solida in faza lichida, rezulta suspensia, iar cea lichida in lichid - emulsie.
Pentra solutiile coloidale (dar proteinele formeaza solutii coloidale) e caracteristic:
a) fenomenul lui Tindal pozitiv;
-49-
b) nu difundeaza prin membrane semipermeabile, care u§or transfera apa sau substantele micromoleculare. Procesul e numit dializa §i sta la baza functionarii aparatului rinichiului artificial. Majoritatea membranelor biologice normale nu sunt penneabile pentru proteine;
c) substantele ce fonneaza solutii coloidale nu se crislalizeaza la marirea concentra- tiei, dar gcncrcaza precipitat amorf. Proteincle pot fonna cnstale numai in anumite conditii, din solutia-mama;
d) solutiile coloidale au o viscozitate marita ce depinde de masa §i fonna mole- culelor. Proteinele de aceea§i masa moleculara, dar cu molecule asimetrice, au o viscozitate mult mai mare. Substantele coloidale interactioneaza cu apa. In proteine gmpele ionogenice leaga apa: COOI I - 4 molecule de H20, NH2- 3 molecule, OH §i NH - cite 2 molecule;
e) viteza de difuziune e foarte mica. Difuzia este procesul sumar de transfer al moleculelor dizolvate sub influenta gradientului de concentrate. Coeficientul de difuzie depinde de marimea §i forma moleculelor, de rezistenta determinate de vis- cozitatea solventului. Procesul de difuzie constituie baza functionarii celulei, transferului de substante. Viteza difuziei §i distanta la care pot fi transportati diferiti metaboliti in celula sunt parametrii principali ce limiteaza metabolismul in celulele vii §i organitele lor;
f) solutiile coloidale in concentratii rnari au o presiune osmotica mica. Ea depinde de numarul particulelor dizolvate in unitate de volum, dar nu de natura lor;
g) au tendinta de a forma diferite complexe moleculare;
h) sunt capabile de absorbtie §i singure se supun absorbtiei;
i) se tumefiaza §i se coaguleaza.
Solutiile coloidale capata fonna de sol — solutie lichida cu o anumita fluiditate §i compozitie de gel, pierzindu-§i fluiditatea dm cauza formarii stmcturii de retca interna cu fixarea apei. Atare structuri apar: 1) la tumefierea xerogelului (agar-agar, clei, gelatina);
2) in unna polimerizarii fibrinogenului; 3) in urnta condensarii amidonului, gelatinei.
La invechirea gelului are loc sinereza, proces de expulzare a apei datorita contractiei structurilor fonnate din particulele coloidale §i eliminarea solventului imobilizat. Apa inclasa in reteaua structurala e numita imobilizata, pe cind apa structurala e legata de gmpele hidrofilc interne ale macromoleculei protcicc. Sinereza are loc la coagularea singelui, in procesul de retractie a cheagului.
Proprietatile electrochimice
Proteinele sunt amfoliti macromoleculari, inglobind un numar redus de grupari acide si bazicc. Contributia cea mai importanta o au resturile de glutamil, aspartil, lizil, arginil §i histidil. Resturile aminoacide de la capetclc C ?i N tenninale nu au o inlluenta semnificativa, mai ales cind lantul polipeptidic este mai lung. Gmpele ionizate suntdispuse in interioml suprafetei moleculare.
Proprietatile acido-bazice sunt determinate de numarul mare de gmpe ionizate ale resturilor de aminoacizi. De predominarea lor depind proprietatile electrice. In albumina exista 109 rcsturi de COOI I §i 120 de NH,; hcmoglobina contine 48 COOH §i 48 NH,. Sarcina clectricac determinata de stmeturaproteinei.
Moleculele proteice, Hind electroliti amfoliti, interactioneaza cu acizii §i cu baz.ele,
-50-
participa la mentinerea pH. In intervalul 6-7 al pH capacitatea-tampon a proteinelor c foarte mica. Numai aminoacidul histidina poseda proprietati tampon la valori normale ale pH. Hemoglobina (Hb) eritrocitclor, transferind O,, sc caracterizeaza prin continut evident de histidina, de aceea $i are Hb - aceste proprietati - tampon la pH = 7.
Particulcle proteice in solutie pot sa-s?i schimbe sarcina electrica in depcndenta de pH. In solutie acida are loc inhibarea disociatiei COOl I §i, avind sarcina pozitiva, protcina migreaza spre catod, in solutie bazica invers—spre anod.
R-COOH
|
NH2
+HC1
R- COOH
1
NH3C1
R-COOH IT R-COONa
+NaOH
NH2 NH2 +t
pH - solutiei, in care proteina apare cu o sarcina electrica nula, numarul gruparilor (+) este egal cu acela al gruparilor (-), este denumitpHizoelectric saupunct izoelectric (pi). Valoarea pi depindc de compozitia proteinei in aminoacizi. O proteina ce arc surplus de lizina §i arginina denota un pi >7, iar aceea care are o proportie mare de aminoacizi dicarboxilici - pi < 7.
R COO +H+ R—COOH R—COO +QH" R~ COO'
|+ —> 1+ 1+ —> I +h2o
nh3 nh3 nh3 nh2
in tabelele 1.4. §i 1.5. sunt date valorilc pi ale unor aminoacizi §i ale unor proteide. La pH izoelectric solubilitatea, mobilitatea proteinei in cimpul electric este minima; pentru fiecare protcina e caracteristic pi propriu. Valoarea lui e determinata de numarul de grupe ionizate §i de valoarea constantelor de ionizare (ribonucleaza—7,8; citocromul — 10,6; pepsina—1,0). in pi molecula proteicae cu sarcina nula §i intre moleculele invecinate nu apar forte electrostatice de respingere, ceea ce inseamna ca in atare conditii solutiile sunt nestabile.
5
Tabelul 1.4. Valorile punctului izoelectric pentru unii aminoacizi proteinogeni
Aminoacid
Pi
Aminoacid
Pi
Acid L-aspartic
2,77
L-Valina
5,96
Acid L-glutamic
3.22
L-Leucina
5,89
L-Cisteina
5,07
L-Izoleucina
6,00
L-Cislina
5,66
L-Glicocol
5,97
L-Tirozina
5,66
L-Alanina
6,00
L-Serina
5,08
L-Prolina
6,30
L-Fenilalanina
5,48
L-Histidina
7,59
L-Triptofan
5,80
L-Lizina
9,74
-51 -
Tabelul 1.5. Valorile punctului izoelectric pentru diferite proteide
Proteide
pi
Proteide
pi
Pepsina
1,0
Fibrinogen
5,5
Cazeina
4,6
Y - globulina serica
6,7
Ovalbumina
4,6
Hemoglobina
6,9
Albumina serica
4,9
Mioglobina
7,0
Ureaza
5,0
Chimotripsinogen
9,5
Insulina
5,4
Citocrom C
10,6
Miozina
5,4
Lizozim
11,0
Evident cS prezenta sarcinilor antipode pe segmentcle distantate ale particulelor cre- eazS conditii pentru o agregare rapidS cu formarea agrcgatelor mari. Acest lucru favori- zeazS precipitarea lor §i la asemenea valori ale pH au o solubilitate mica. Astfel de particularitate este caracteristicS mai ales proteinelor globulare.
La valori mai mici sau mai mari de pi toate moleculele au accea§i sarcina §i, ca rezultat, sc resping una pc alta, agregarea bind imposibila. A§adar, sarcina electrica e un factor stabilizant al solutiilor coloidale. In solutii supraacide sau suprabazice proteina nu va precipita chiar la fierberc, adica nici chiar atunci cind i$i va pierde proprietStile hidrofile. Se §tie ca unfactor stabilizator al solutiilor coloidale e membrana apoasd. Solubilitatea proteinelor e dependents de hidratarea moleculara a lor, adica a gmpelor ionizate. Apa, jonctionindu-se de pe suprafata moleculelor §i cuplindu-se sub o formS de dipoli, formeazS membrana apoasa care impiedica aditia, fuzionarea particulelor coloidale §i in punctul pi.
Apa specific orientatS In jurul grupelor hidrofile e numita apa legato §i se caracterizeaza prin :
a) dispunere mai compacts, cc o apropie dc un corp solid;
b) proprietati reduse dc solvent;
c) nu ingheata la temperaturi joasc;
d) constanta diclectrica estc cgalS cu 2,8, pe cind la apa obi$nuitS este de 8 (constan- ta dielectrics este forta de atractie a ionilor incarcati opus). Prin urmare, factor'd stabilizatori ai sistemului coloidal sunt sarcina electrica §i membrana apoasd.
Precipitarea $i denaturarea proteinelor
Pentru aplicarea acestor proprietSti ale moleculei proteice e necesar de a o lipsi anume de stabilizatori. Metodele sunt diferite. In medicinS ele sunt folosile pentru caracteristica cantitativS ?i calitativaa proteinelor, din component biologici: urinS, singe, exudatetc.
Inlaturarca sarcinii electrice se efectueaza prin aducerea proteinei la starea pi. DacS drcpt ion de precipitate se folose^te cationul, precipitarea e mai favorabila in solutie slab
-52-
alcalina; daca e folosit anionul, atunci solutia trebuie sa fie putin acida—pentru a aduce particulele coloidale in starea electroneutrd.
Membrana apoasS poate fi inlaturata cu ajutoml dehidratantilor (alcool, acetonS). Ultimii leaga apa. Dehidratantii au o constants dielectrics micS, mic§orind-o §i pc cea a solutiei. In consecintS, ei mSresc atragerea intre douS sarcini antipod, creind astfel conditii pentru formarea perechilor de ioni ce favorizeazS agregarea proteinelor.
Corpurile proteice constituie o confonnatie nativS §i posedS anumite calitSti fizico- chimice §i biologice in conditii normale ale T, pH etc. Conformatiile sunt extrem de fragile §i u$or perturbabile sub actiunea multor agenti, care afecteazS interactiunile covalente din continutul moleculei. Modificarile conformatiei native unice se nume§te denaturare, iar agentii care o provoaca — agenti denaturanti. Denaturarea e o particularitate a proteinelor.
La denaturare sunt lezate legSturile necovalente; agentii denaturanti nu afecteazS legSturile covalente, nu sunt lezate nici jonctiunile peptidice, nu se eliminS ami- noacizi. Structure primarS a proteinei rSmine neafectatS.
TrSsSturile caracteristice ale proteinei denaturate:
1) pierderea sau mic§orarea activitStii biologice;
2) mic§orarea solubilitStii;
3) schimbarea fomiei §i mSriinii moleculelor;
4) modificarea caracterului dispersiunii razelor Roentghen;
5) cre§terea rcactibilitStii unor grape (SH);
6) aparitia unor grape functionale anterior nedetenninate;
7) pierderea capacitatii de a se cristaliza;
8) scSderea capacitStii de rezistentS la hidrolizS;
9) capacitatea sporitS de a da reactii de culoare;
10) mic?orarea mobilitStii electrice.
Denaturarea este provocatS de diferiti agenti: temperature inaltS, sSrari ale metalelor grele care in concentratii mici produc denaturarea, coagularea proteinei. Proteina coa- gulatS din solutie se leagS $i se precipitS cu factoral nociv. Fenomenul e utilizat in practica medicals. La intoxicatie cu sublimat bolnavului i se administreazS lapte, ovalbumins in cantitSti mari. Proteina fonneazS, in ansamblu cu substantele toxice, un precipitat ce mic§oreazS absorbtia lui. In unele conditii proteina denaturatS poate rSmine in solutie, dacS aceasta este acidS sau alcalinS, chiar §i la temperature de 100°C. Precipitatul va apSrea la neutralizarea solutiei.
La o actiune de scurtS duratS §i la eliminarea rapidS a agentului denaturant e posibilS renaturarea proteinei cu restabilirea activitStii ei biologice. Denaturarea e ireversibila atunci cind se rap legSturile chimice, in special cele disulfidice inter- §i intracatenare.
In procesul de sterilizare are loc denaturarea teraiicS §i, in consecintS, insuficienta de timp sau de t° duce la generarea §i rSspindirea microbului etc.
Multc proteinc nu sc denaturcazS la sublimarc (liofdizare). Lotusi, uncle cnzimc i§i diminueazS activitatea. E necesar sS §tim cS exists substante ce pot impiedicadenaturarea, $i anume: solutia de glucide simpla saturata, alcooli multiatomi (glicenna), unii anioni organici (dodecilsulfat, unii acizi gra§i) etc. Pentru a evita denaturarea proteinele se izo-
- 53-
leaza. Ele se pastreaza la rece, in solutii concentrate de saruri §i la un pH anumit.
Metodele de identificare a proteinelor. Problema elucidat'd complete a structurii macromoleculare a proteinelor este una dintre cele mai actuale §i de o incontestabila important teoretica §i practica. Pentru determinarea masei moleculare proteice pot fi utilizate unnatoarele metodc: marimea presiunii osmotice, Constanta ultracentrifiigarii (proteinele sedimenteaza in raport cu marimea ?i masa lor); metoda difuziunii luminii (intensitatea difuziunii e dependents de numarul particulelor §i de masa lor moleculara); marimea difractiei razelor Roentghen, microscopia electronica; continutul unor elemente (in Hb concentratia Fe este egala cu 0,34%), care se contin in cantitati mici (in albumina sericS concentratia triptofanului e de 0,58%).
Masa moleculara _ Masa atoinului x 100 minima a proteinei Cantitatea elementului in %
Masa moleculara a albuminei (Trp)
204x 100
0,6
= 34000 Da
Masa moleculara a hemoglobinei (Fe)
2)6 X 100 = 16470 Da
0,34
Stabilirea structurii unei proteine incepe cu izolarea $i purificarea ei, determinarea masei moleculare, identificarea calitativa §i cantitativa a aminoacizilor componenti, modului lor de legare, secventa aminoacizilor, in fine, cu orientarea tridimensionala a macromoleculelor.
1. Proteinele se separa de celelalte componente prin dializa, utilizindu-se membrane semipenneabile. Pentru accelerarca procesului se aplica electroliza — electrodiaiiza.
2. Solutiile proteice se purifica, diferentiindu-se dupa marime §i forma prin filtrarea cu geluri speciale care fiinctioneaza ca site moleculare — moleculele de marimi mici se repartizeaza intre faze, iar cele mai mari nu patrund in faza interna. Moleculele asimetrice pot sa nu patrunda in faza interna. (Granulcle porozitate de gel sunt suspendatc intr-o solutie, formind 2 faze - una interna — in granule, §i alta externa—in afara lor). In cazuri apartc la purificarea unor enzime se pot utiliza §i alte metode. Se observa afinitatea lor cu diver§i ioni, grupe functionale — cromatografia de afinitatc (fig. 1.15 a,b,c).
a) Cromatografia prin schimbatori de ioni este bazata pe distingerea semnului §i sareinii electrice la pH-ul dat. Coloana matrice prezinta un polimer sintetic ce confine grupari fixate. La legarea gruparilor anionice matricea este schimbatoare de cationi, iar la fixarea gruparilor cationice—schimbatoare de anioni. Afinitatea proteinei pentru gruparile fixate in coloana este influentata de pH (starea ionizanta a moleculei) §i de concentratia ionilor salini din mediul respectiv. Separarea poate fi optimizata prin schimbarea succesiva a pH-lui §i /sau a concentratiei saline a fazei mobile.
b) Gel - filtrarea separa proteinele in dependents de dimensiuni. Matricea coloanei prezinta un polimer fixatce confine pori cu anumite marimi. Proteinele man migreaza mai
-54-
a)
Granule polimerice cu grupari functionate incarcate negativ
A mextecuI proteic este adaugat in coloana ce confine schimbatori de f|-" ' cationi •
;;
i?
Proteinele tree prin coloana la rata determinata de sarcina lor la pH-ul dat. Proteinele cu sarcina negativa tree mai repede fi sunt eluate mai rapid
I 1 a < 5 «
/"
Wf
Amestecul proteic este adaugat in coloana ce confine un ligand fixat la polimer, specific pentru proteina ce prezinta interes
Proteina ce prezintS interes este eluatd cu ajutorul solutiei ce confine ligand liber
.\foleculele proteice se separa in dependenfa de dimensiune: moleculele mai mari tree mai liber fi apar in fraefiile timpurii
Proteinele nedorite sunt spalate din coloana
Kigura 1.15. Metode cromatografice utilizede pentru puriftcarea protein el or:
a) cromatografia prin schimbatori de ioni; b) gel-filtrarea; c) cromalografia de afinitate
-55-
rapid dccit ccle mici (nu patrund in porii granulelor). Proteinele mai mici intrS in pori, sunt retinute, avind o cale mai lungS de traversat.
c) Cromatograjia de afmitate separS proteinele in dependents de specificitatea lor de legare. Proteinele retinute in matrice sunt fixate specific de liganzi prin legaturi transversale (termenul «ligand» se refers la o grupS sau o moleculS care se leaga de macromolecule de tip proteic). DupS eluarea proteinelor nefixate in coloanS, proteina legatS de interes particular este eluata prin intennediul unei solutii ce confine ligand liber.
in .'jtiinta contemporanS este pe larg utilizatS metoda elecroforezei (fig 1.16a). Diferite probe sunt introduse in rezervoarele ce contin gel de poliacrilamida. Proteinele tree in gel, unde este aplicat un cimp electric. Dupa citeva ore de la efectuarea elecroforezei, proteinele pot fi vizualizate prin tratarea gelului cu diferiti coloranti (albastru de metilen), care se fixeazS de proteine, dar nu la gel. Fiecare bands din gel reprezintS o proteina individuals. Proteinele mai mici migreazS mai rapid $i sunt depistate mai departe de baza gelului. in fugurS este ilustratS purificarea enzimei RNA polimeraza din E.coli. Prima bands corespunde proteinelor prezente in extractul cclular nativ.
NecesitStile $tiintifice impun utilizarea elecroforezei cu cromatografia verticals sau focalizarca izoelectricS — electroforezd bidimensionala.
in focalizarea izoelectricS (fig. 1,16b), tehnica modems permite separarea proteinelor in dependents de punctul lor izoelectric (tab. 1.5).
Un gradient constant al pH-lui este stabilit in gel prin adausul amfolitilor potriviti (1). Amestecul proteic este plasat intr-un rezervor in gelul la care se aplieS un cimp electric
(2) . Proteinele pStrund in gel $i migreazS pinS ce fiecare atinge pH-ul echivalent pi propriu
(3) . Amintim cS atunci cind pH este egal cu pi, sarcina nets a proteinei este egalS cu zero, in figurS sunt arState proteinele dupS coloratie, care sunt distribuitc dc-a lungul gradientului pH-lui in dependents de valoarea pi.
in electroforeza bidimensionalS (fig. 1.16c) proteinele initial sunt separate prin focalizarea izoelectricS intr-un gel cilindric. Apoi gelul este amplasat orizontal pe un alt gel in formS de placS, unde proteinele sunt separate prin elecroforezS in gel de
-56-
*
pi ..... *■
■»)©)
Focalizarea
izoelectrica
Mr
Electroforeza »
<->
« f * t
Gelul focalizat
I
izoelectric este
iii « » j
plasatin
........->
gelid de
W . . Pi
y-s poliucrilamida
4 .it
■ ;
®PSfe§|
Figural.16. c) elecroforeza bidimensionald
poliacrilamida. Separarca orizontala reflects diferentele de pi, iar cea verticals — masa moleculara. Utilizind aceastS tehnicS, pot fi separate mai mult de o 1000 de diverse proteine din E. coli.
Mobilitatea electroforetica a proteinei in gel de poliacrilamida poate fi utilizatS $i in determinarea masei moleculare (tig. 1.17).
Proteinele standarde cu masa moleculara cunoscutS sunt supuse electroforezei. Aceste proteine - marker (1.17a) pot fi utilizate pentru a estima masa moleculara a proteinelor necunoscute.
In (1.17b) este redata dependenta logaritmului masei moleculare a proteinelor marker versus migratiei relative la o electroforeza liniarS. Graficul respectiv pennite determinarea masei moleculare a proteinei necunoscute. La moment sunt cunoscute metode mult mai sofisticate de purificare ?i apreciere structural a proteinelor.
a)
1 2
©
-Ljr~Ljr
Miozina
200,000
fi-galactozidaza
116,250
Glicogen fosforilaza f}
97,400
(■■MM*
Proteina
Seralbumina
66,200
studiata
Ovalbumina
45,000
■
Carhanhidraza
31,000
—
Inhibitorul tripsinei Lizozimtil
21,500
14,400
—
©
Mt standard
Figura 1.17. Estimarea masei moleculare
-57-
Niciun comentariu:
Trimiteți un comentariu